竹叶提取物的体外抑菌及抗氧化活性的研究

倪向梅，曹光群

江南大学化学与材料工程学院，无锡214122

竹叶提取物的体外抑菌及抗氧化活性的研究

倪向梅，曹光群*

江南大学化学与材料工程学院，无锡214122

本文用水提取竹叶有效成分，将提取液浓缩至含生药量约1.0 g/mL，经醇沉后取清液浓缩，再经石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取，得不同极性的各部分提取物。以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试菌，采用抑菌圈法(琼脂扩散法)和最低抑菌浓度(MIC)法测定其抑菌效果。结果显示，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯部分均表现抑菌活性。各供试样对两种菌的抑菌圈直径达9.8～18.4 mm，最低抑菌浓度分别为1.25 mg/ mL，2.50 mg/mL和5.00 mg/mL。最后采用亚硝基红盐-Co2+褪色法研究了竹叶提取物对·OH的清除作用，结果表明三氯甲烷和乙酸乙酯部分萃取物的抗氧化性明显优于水提物，其中乙酸乙酯部分萃取物的IC50值为1.06 mg/mL。

竹叶提取物;抑菌活性;抗氧化性;自由基清除

化妆品中使用的各种原料和添加剂多数易受微生物侵蚀而导致产品变质，随着消费者对产品安全意识的增强，化妆品防腐问题越来越受到重视。对羟基苯甲酸酯类是目前应用于个人护理产品最广泛的防腐剂之一，Routledge等人［1］的研究首次发现对羟基苯甲酸酯具有雌激素活性，会对消费者的身心健康带来不利。因而，从天然产物中寻找高效低毒的新抑菌剂替代合成防腐剂已成为中草药的研究方向之一。

中国素有“竹子王国”之称，种类、面积和竹材产量均占世界1/3左右。但相对于竹木和竹笋的利用来说，竹叶作为剩余产物往往被舍弃，造成了极大的资源浪费。近年来，大量研究表明竹叶中含有黄酮类、酚酸类、蒽醌类化合物、生物活性多糖、氨基酸肽类、萜类内酯等活性成分［2］，具有显著的抗自由基、抗氧化、抗菌抗病毒等生理活性。最早由李惠珍等［3］发现竹叶具有优良的防腐性能，能加入食品作为天然的食品保鲜剂、防腐剂，稳定性好，毒性小。

近年来，有关竹叶提取物的抑菌和抗氧化作用已有不少研究报道。但对竹叶提取物抑菌作用的研究仅停留在比较不同溶剂提取或不同提取条件下得到提取物的抑菌效果［4，5］，抗氧化性研究主要考察竹叶乙醇提取物对自由基的清除以及抗脂质氧化［6］的作用，马世玉［7］等人的研究表明竹叶水提液能提高心、脑组织及全血中抗氧化酶的活性，抑制自由基损伤，防止脂质过氧化。

本实验采用水作溶剂提取竹叶有效成分，将水提液经乙醇沉淀预处理后，用四种有机溶剂萃取得到极性不同的五个部分，分别对竹叶各萃取物进行抑菌活性以及清除自由基能力的研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SW-CJ-1G型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);SPX-250型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂);DSX-280A型不锈钢高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂);DZF-6020型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);HH-2型数显恒温水浴锅(金坛市荣华仪器制造有限公司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 材料

原料:竹叶于2009年6月采于浙江龙游溪口镇，干燥后备用，经南京野生植物综合利用研究院植物资源化学研究室鉴定为毛竹(Phyllostachys pubescens Mazel ex H.de Leh.)竹叶;

试剂与药品:石油醚(60～90℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸钴(CoSO4·7H2O)、亚硝基红盐(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);无水碳酸钠(分析纯，上海虹光化工厂);碳酸氢钠(分析纯，济南化工厂分厂);过氧化氢(分析纯，上海桃浦化工厂);对羟基苯甲酸乙酯(化学纯，中国医药集团化学试剂有限公司)、BHT(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)

菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Sa)、大肠杆菌(Escherichia coli，Ec)由江南大学食品学院微生物实验室提供

培养基:蛋白胨牛肉膏培养基［8］:蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。用1 mol/L NaOH溶液调节pH值为7.0～7.5;121℃，0.15 MPa下湿热灭菌20 min

2 试验方法

2.1 竹叶水提物及溶剂萃取物的制备

具体提取流程见下图:

图1 竹叶提取工艺流程Fig.1 The flow chart for extraction technics of bamboo leaves

2.2 抑菌活性试验方法

2.2.1 供试菌悬液及样品的制备

菌种活化:将供试菌种接种于固体培养基斜面，于37℃下培养活化24 h。

制备供试菌悬液:取一环活化供试菌于装有50 mL无菌液体培养基的三角瓶中，于37℃下培养12～18 h，制得初始菌悬液。用无菌生理盐水按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的顺序依次梯度稀释成5个浓度，各取200 μL涂布平板，37℃放置24 h后计数，直至将菌悬液调为合适的浓度，作为供试菌悬液。

对照品溶液的制备:准确称取0.1 g对羟基苯甲酸乙酯，溶于0.5 mL无水乙醇，制得0.2 g/mL对照品溶液。

供试样品溶液的制备:将上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部分萃取物浸膏，视溶解性分别用适当溶剂溶解，仿照对照品溶液的制备方法配制成0.2 g/mL浓度。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ用相应萃取溶剂溶解，Ⅴ用水溶解;实验中发现Ⅲ部分浸膏在乙酸乙酯中溶解性并不好，故选择50%乙醇作为溶剂。

2.2.2 抑菌圈法(琼脂扩散法)［9］

将20 mL灭菌琼脂培养基倒入无菌培养皿制平板，冷却后注入上述1×106CFU/mL菌悬液200 μL，用无菌棒涂抹展开至培养基表面。取直径6 mm的滤纸片，放入样品溶液中浸泡30 min，取出晾干后贴在含菌平板上，每皿3片对照，每个浓度平行作2皿。同时将滤纸片浸在各样品溶剂中，作同步抑菌实验进行空白对照。将培养皿倒扣，置于37℃培养箱中培养24 h后取出，测量抑菌圈直径，每个抑菌圈在垂直方向上测两次取平均值。抑菌圈越大，表示抑菌效果越好。

2.2.3 最低抑菌浓度(MIC)法

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试细菌，先按2.2.1的方法将供试菌悬液浓度调为5×104～5 ×105CFU/mL［10］。根据2.2.2的实验结果，将显示明显抑菌圈的样品进行MIC值的测定。实验分四组进行，每组7支试管，分别考察对照品及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分萃取物浸膏对两种细菌的MIC。

采用试管等倍稀释法，先往每支灭菌试管中各加入1 mL无菌生理盐水，在试管1中加入0.2 g/ mL的供试样品溶液1 mL，混匀后从中取出1 mL加入试管2，依次类推，最后一个试管中弃去1 mL。至此，将原液制备成一系列不同浓度的稀释液。再往每支试管中吸入19 mL培养基，充分混匀，趁热倒入无菌培养皿中，待培养基凝固后，吸取200 μL上述浓度的菌悬液，接种在培养基上，于37℃恒温培养24 h，观察细菌生长情况。以完全无菌生长的最低浓度作为供试样品溶液的MIC值。实验中，同时以1 mL无菌生理盐水代替竹叶提取物溶液与培养基混合作平板对照。

2.3 抗氧化活性试验方法

采用亚硝基红盐-Co2+褪色法研究对·OH的清除作用［12］。H2O2/Co2+体系可类似Fenton反应产生·OH:Co2++H2O2=Co3++OH-+·OH，且产率较H2O2/Fe2+高得多。利用H2O2/Co2+体系产生·OH氧化亚硝基红盐-Co3+配合物，可使其在410 nm处的最大吸收峰减弱或消失。根据此原理建立了以A410变化反映·OH氧化作用的光度测量方法。

3 结果与讨论

3.1 竹叶水提物及溶剂萃取物的得率

表1 竹叶水提物及各萃取物得率Table 1 Extraction rate of water extract and various fractions of bamboo leaves by extracting

3.2 竹叶水提物及溶剂萃取物的抑菌效果

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌，分别测定竹叶水提物和溶剂萃取物的抑菌效果，并与对羟基苯甲酸乙酯进行比较，所有样品的溶剂作同步抑菌实验对照。

由图2和表2可知，各供试样品对大肠杆菌的抑制作用稍强于金黄色葡萄球菌，石油醚部分和三氯甲烷部分萃取物对这两种菌的抑菌作用比较显著，与常用防腐剂对羟基苯甲酸乙酯差异较小;乙酸乙酯萃取物也有一定的抑菌效果，但不及前两个部分。其中，石油醚萃取物具抑菌效果在竹叶相关研究中未见报道。各供试样品所用的溶剂在相同实验操作条件下均未体现抑菌作用或作用甚微。

表2 各溶剂的抑菌活性实验结果Table 2 Result of antibacterial activity experiment on each solvent

图2 竹叶水提物、各萃取物和对羟基苯甲酸乙酯的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of water extract and various fractions of bamboo leaves with ethylparaben as reference

可见，将竹叶水提物经过萃取分离后，有效物分布得到相对集中，因此抑菌活性明显增强，这为进一步探究竹叶中有效抑菌成分指明了方向。

3.3 竹叶萃取物的最低抑菌浓度(MIC)值

采用最低抑菌浓度(MIC)值法进一步考察提取物的抑菌活性，结果见表3所示。石油醚部分萃取物的MIC值为1.25 mg/mL，三氯甲烷部分萃取物的MIC值为2.50 mg/mL，乙酸乙酯部分萃取物的MIC值为5.00 mg/mL。三者最低抑菌浓度(MIC)值的结果比较与3.2中抑菌圈直径实验结果基本一致。其中，对照样品对羟基苯甲酸乙酯的最低抑菌浓度(MIC)实验值为1.25 mg/mL，与文献报道值1000 ppm也基本一致。

表3 三部分提取物与对羟基苯甲酸乙酯的最低抑菌浓度值(MIC)的比较Table 3 Minimal inhibitory concentration(MIC)of the first three fractions from extract with ethylparaben as reference

3.4 竹叶提取物抗·OH自由基氧化试验结果

按2.3的公式计算加入不同浓度提取物后对亚硝基红盐-Co2+体系产生的·OH自由基的清除率，如图3所示。随着提取物浓度的增加，对·OH自由基的清除效果也逐渐增强，表明提取物对自由基的抑制能力与浓度呈明显的量效关系。试验发现，有显著抑菌活性的三氯甲烷及乙酸乙酯萃取物浸膏同时具有良好的抗氧化活性，各部分对·OH自由基的清除作用为:乙酸乙酯萃取物＞三氯甲烷萃取物＞水提物。其中，乙酸乙酯萃取物在体系中的IC50值为1.06 mg/mL，与对照品BHT近乎相当。

4 结论

本实验采用水提取竹叶中有效成分，研究了竹叶水提取物以及不同溶剂萃取物的抑菌活性及抗氧化性，实验发现，竹叶水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用，但抑菌效果不显著，抑菌圈直径仅为7.8 mm和8.6 mm。将水提液醇沉处理后，继而经不同极性的溶剂萃取，使有效抑菌成分得到集中，结果表明石油醚部分、三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分均具有抑菌活性，且对大肠杆菌的抑制作用稍强于金黄色葡萄球菌。抑菌圈法(琼脂扩散法)和最低抑菌浓度(MIC)法结果表明三部分提取物对两种供试菌的抑菌圈直径达9.8～18.4 mm，最低抑菌浓度分别为1.25 mg/mL，2.50 mg/mL和5.00 mg/mL，其中石油醚部分具抑菌效果在竹叶相关研究中未见报道。了解活性成分在植物中的极性分布范围，对天然植物有效成分的提取具有指导性的意义。

图3 不同浓度竹叶提取物对·OH自由基的清除作用的影响Fig.3 The effect of the concentration of bamboo leaves extract on·OH free radicals scavenging activity

通过亚硝基红盐-Co2+褪色法研究对·OH自由基的清除率，结果表明竹叶水提物的三氯甲烷及乙酸乙酯萃取物浸膏同时具有良好的抗氧化活性，且各部分对·OH自由基的清除作用为:乙酸乙酯萃取物＞三氯甲烷萃取物＞水提物。其中，乙酸乙酯萃取物在体系中的IC50值为1.06 mg/mL。

竹叶提取物不仅具有明显的抗菌作用，同时也具有抗氧化作用，因此，竹叶提取物是一种有开发价值的天然防腐剂和天然抗氧化剂。

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In vitro Antibacterial and Antioxidant Activity of Bamboo Leaves Extract

NI Xiang-mei，CAO Guang-qun*
Schoo1 of Chemica1 and Materia1 Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China

The bamboo leaves extract was obtained by decocting with water and then deposited with ethanol to remove the sample matrix.Water extract was further extracted by four different polarity solvents i.e.petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n-butanol，successively.Antibacterial activity on Staphylococcus aureus and Escherichia coli of the four fractions were studied by inhibition zone method(agar diffusion method)and minimal inhibitory concentration method (MIC)comparing with ethylparaben.The results indicated that the petroleum ether，chloroform，and ethyl acetate fractions exhibited significant inhibitory effects on both kinds of bacteria.The inhibition zones of samples for test were between 9.8 and 18.4 mm and minimal inhibitory concentration(MIC)were 1.25 mg/mL，2.50 mg/mL，and 5.00 mg/ mL，respectively.Finally the scavenging effect on·OH radical of bamboo leaves extract was studied by Nit-R-Co2+system，it was found that the chloroform and ethyl acetate fractions also possessed significant antioxidant activity，and IC50of ethyl acetate extract was 1.06 mg/mL.

bamboo leaves extract;antibacterial activity;antioxidant activity;free radicals scavenging

1001-6880(2011)04-0717-05

2010-07-21 接受日期:2010-11-17

*通讯作者 Tel:86-013706182565;Email:gqcao@jiangnan.edu.cn

R284.2;Q946.91

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