中介素1-53对肺缺血再灌注损伤大鼠NF-κB和CINC-1的影响

赵 卉 刘 妮 杨淑娟 李建强

中介素1-53对肺缺血再灌注损伤大鼠NF-κB和CINC-1的影响

赵 卉 刘 妮 杨淑娟 李建强＊

（山西医科大学第二临床医学院呼吸内科，太原030001）

目的 探讨中介素1-53对大鼠肺缺血再灌注损伤后核因子-κB（NF-κBp65）和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化物（CINC-1）蛋白表达的影响。方法 将健康Wistar大鼠54只随机分为手术对照组（C组）、缺血再灌注组（IR组）、中介素干预组（D组）。每组分别在缺血45min，再灌注60min、120min 3个时点处死6只大鼠，观察肺组织病理形态变化，测定肺组织湿干质量比值（W／D）、髓过氧化物酶（MPO）活性，肺组织匀浆CINC-1蛋白含量及NF-κBp65蛋白的表达。结果 IR组的W／D值、MPO活性、NF-κBp65和CINC-1的蛋白表达均高于C组，中介素1-53干预后各值较IR组有所下降；D组肺组织病理学变化较IR组明显减轻。结论 中介素1-53的应用可以减轻肺缺血再灌注损伤，作用机制可能与其抑制NF-κB的活化，降低肺组织CINC的表达，从而减少肺内PMN的浸润密切相关。

肺；缺血再灌注损伤；中介素1-53；NF-κBp65；中性粒细胞趋化因子-1

近年来，肺缺血再灌注损伤（LIRI）一直是影响肺栓塞溶栓治疗、心肺搭桥术及各种体外循环术预后的一个重要因素，因此，寻找治疗LIRI的药物势在必行。中介素（IMD）是一种新的降钙素（CT）／降钙素基因相关肽（CGRP）家族肽，它的一个重要肽段IMD1-53，目前报道其有抑制炎症细胞浸润，减少自由基的生成，扩张血管等生物学效应［1-3］，但中介素1-53对肺缺血再灌注损伤的研究尚未见报道。本实验拟通过建立大鼠在体肺缺血再灌注模型，在缺血再灌注前给予IMD1-53，来探讨外源性人工合成的IMD1-53对肺缺血再灌注损伤的作用及其可能机制。

材料和方法

1.材料

健康雄性Wistar大鼠54只（山西医科大学动物中心提供），体重220-300g。合成的大鼠中介素1-53（IMD1-53）（美国 Phoenix pharmaceutical公司），NF-κBp65多克隆抗体、DAB显色试剂盒（福州迈新生物有限公司），CINC-1ELISA试剂盒（美国R＆D进口分装公司），髓过氧化物酶（MPO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2.方法

2.1 动物模型的建立：健康 Wistar大鼠，3%戊巴比妥钠50mg／kg腹腔注射麻醉后，尾静脉注射肝素（100U／kg）。仰卧位固定，气管切开后插管，接动物呼吸机行机械通气，经胸骨右缘第3-5肋间开胸，游离右肺门，下穿手术线，静息5min后，于呼气末结扎右肺门（右主支气管，右肺动、静脉），缺血45min后开放，使肺充盈再灌注120min，制成在体肺IR模型。

2.2 实验动物与分组：大鼠54只随机分为3组，每组18只。正常对照组（C组）：开胸游离右肺门后，不行夹闭阻断。缺血再灌注组（IR组）：开胸游离右肺门后，夹闭阻断45min，继行再灌注120min。中介素干预组（D组）：于缺血再灌注前一小时将2nmol／kg的中介素1-53溶于1ml生理盐水腹腔注入。各组分别于缺血45min，再灌注60min、120min 3个时点采集标本。

2.3 病理检查：取右肺中叶约1cm×1cm×1cm大小组织块，用10%甲醛固定，予以常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

2.4 免疫组化法测肺组织NF-κBp65：采用免疫组织化学染色（SP）法检测大鼠肺组织NF-κBp65蛋白的表达。染色阳性结果为细胞内出现棕黄色颗粒。应用图像分析系统进行图像分析，以平均光密度值（IOD）表示。

2.5 肺组织匀浆CINC-1含量：冷冻肺组织称重后，使用PBS（pH＝7.4）缓冲液制成10%匀浆，离心，留取上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定CINC-1含量。

2.6 肺组织W／D比值测定：取1g右肺中叶组织用分析天平称重为湿质量，置于70℃电热恒温干燥箱中烤48h后称重为干质量，湿质量与干质量之比即为W／D。

2.7 肺组织MPO测定：取右肺上叶相同部位肺组织1g，制成匀浆，将制备好的匀浆以3500r／min离心15min取上清液用比色法测MPO。

2.8 统计学处理

计数资料以均数±标准差表示，采用SPSS16.0专用统计软件进行单因素方差分析和t检验处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.病理组织学改变

光镜下可见正常肺组织肺泡壁薄，无明显充血水肿（图1）；IR组肺组织肺泡结构破坏，肺泡隔增宽且肺泡间隔有炎性细胞浸润，肺泡腔内有渗出液、红细胞及渗出的炎性细胞，且IR组肺组织损伤随再灌注时间延长而加重（图2）；D组炎性浸润及肺泡腔内出血、渗出较IR组明显减轻（图3）。

2.肺组织免疫组化 NF-кBp65

NF-кBp65阳性表达在支气管上皮细胞，主要位于细胞核内。C组NF-кBp65表达呈阴性或极弱阳性（图4）；IR组缺血后表达显著升高，并随再灌注时间的延长进行性增高，与C组比较（P均＜0.01）；IMD1-53.干预后 NF-кBp65表达下降有显著意义（P＜0.05）（图5，6）。

3.肺组织匀浆CINC-1含量

与正常对照组比较，IR组各时相点CINC-1含量明显增加（P＜0.05），经IMD1-53干预后CINC-1含量明显下降（P＜0.05）（表1）。

4.肺组织MPO活性的测定

IR组和D组随再灌注时间的延长，MPO活性逐渐升高，且较C组也明显升高（P＜0.05）；但D组肺组织MPO活性要低于IR组（P＜0.05）（表1）。

5.肺组织 W／D

经缺血后，C组与IR组两组大鼠肺组织 W／D比值变化不显著；再灌注后，IR组肺组织W／D比值呈进行性升高（再灌注60min、120min vs缺血45min，P＜0.05）；D组IMD1-53干预后肺组织 W／D比值较IR组明显降低（再灌注60min、120min时，D组vs IR组，P＜0.05）（表1），但仍高于C组。

表1 各组缺血／再灌注不同时点CINC-1含量、MPO活性、W／D比值、NF-кBp65蛋白比较（x¯±s）Table 1 The comparison of the contents of CINC-1，the activity of MPO，the lung W／D and the protein expression of NF-кBp65

讨 论

LIRI的主要病理改变是肺毛细血管内皮细胞受损，肺血管的通透性增加，继而肺血管阻力增加、压力升高，引起肺水肿及气体交换功能受损。其发生机制包括五个方面［4］：①氧自由基及脂质过氧化反应；②细胞内的钙稳态失调；③PMN（中性粒细胞）大量浸润引起的过度的炎症反应；④参与PIRI体液因子的作用；⑤细胞凋亡与肺缺血再灌注损伤。

肺组织W／D比值是常用的评价肺水含量及反映肺微血管损伤的指标，他的增高反映了肺微血管通透性的增加。本实验中IR组W／D进行性升高，使用IMD1-53干预的D组肺组织 W／D值明显降低，且病理切片显示D组的肺组织与IR组相比病理学改变明显减轻。表明IMD1-53干预可以减轻缺血再灌注引起的肺组织损伤。

中性粒细胞（PMN）的肺内聚集和激活在肺缺血再灌注损伤的发生发展中起着重要的作用［5］。目前认为中性粒细胞介导的肺缺血再灌注损伤主要包括2个步骤［6］：①中性粒细胞被激活并在趋化因子的作用下在肺内聚集。②聚集的中性粒细胞通过呼吸爆发和脱颗粒作用释放大量氧自由基、蛋白水解酶，损伤肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞，引起肺损伤。MPO作为PMN的特异性酶，其含量的高低反映PMN的浸润程度。本实验结果显示，D组MPO活性较IR组明显减低。提示给予IMD1-53干预可减轻LIRI时PMN的聚集。而大鼠中性粒细胞趋化因子-1（CINC-1），在结构和功能上对应于人类的IL-8家族成员，对大鼠PMN具有很强的趋化和激活作用［7］。本实验显示IR组各时相大鼠CINC-1浓度显著升高，此效应可以被IMD1-53抑制。这表明IMD1-53的干预可减轻缺血再灌注损伤肺组织中PMN的聚集浸润，这可能与抑制CINC-1的产生有密切的关系。

NF-κB是一种广泛存在于多细胞具有多向性转录调节作用的蛋白因子。NF-κB的激活受多种因素的影响，肿瘤坏死因子（TNF-α）、氧自由基等是其强激活剂［8］。NF-κB一旦被激活，经过复杂的信息传递过程，迅速诱导多种细胞活化基因的转录，翻译。NF-κB可高效诱导多种细胞因子（如：TNF-α，IL-6，IL-8，TNF-β，G-CSF等），黏附分子（ICAM-1，E-selection等），趋化因子（C3，COX-2等）的基因表达［9-11］。NF-κB调节的转录产物是 LIRI炎症反应的主要炎症介质和细胞因子，因而，影响NF-κB则可在转录水平影响多种炎症介质的转录，从而对组织的再灌注损伤产生影响。本实验结果显示，IR组NF-κB的表达比C组明显增高，而缺血前给予IMD1-53干预，则NF-κB的表达较IR组有显著的降低。这提示IMD1-53可抑制肺组织NF-κB，从而抑制多种炎症介质的过度表达，减轻再灌注损伤肺组织中PMN的聚集浸润。但是IMD1-53是通过何种途径或机制影响再灌注损伤肺组织中NF-κB的表达，需进一步的研究。

综上所述，IMD1-53对缺血再灌注引起的肺组织损伤有一定的保护作用，可能的作用机制与其抑制NF-κB的表达，降低肺组织CINC-1的浓度，减少肺内PMN的浸润密切相关。

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图 版 说 明

图1 C组肺组织。HE×200

图2 IR组再灌注120nin肺组织。HE×200

图3 D组再灌注120min肺组织。HE×200

图4 C组可见NF-кBp65表达呈阴性或极弱阳性。SP法×200

图5 IR组再灌120min可见NF-кBp65较正常组表达明显增多。SP法 ×200

图6 D组再灌注120min可见NF-кBp65较IR组表达较弱，但仍高于正常组。SP法 ×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Lung tissue in the C group.HE staining.×200

Fig.2 Lung tissue of 120min reperfusion in the IR group.HE staining.×200

Fig.3 Lung tissue of 120min reperfusion in the D group.HE staining.×200

Fig.4 Expression of NF-кBp65in the C group.SP method×200

Fig.5 Expression of NF-кBp65in the IR group.SP method×200

Fig.6 Expression of NF-кBp65in the D group.SP method×200

Effects of intermedin 1-53 on nuclear factor-κB and cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1 in lung ischemia-reperfusion injury of rats

Zhao Hui，Liu Ni，Yang Shujuan，Li Jianqiang＊
＊ （Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，
Taiyuan030001，China）

Objective To investigate the effects of IMD1-53on the protein expression of nuclear Factor-κB （NF-κBp65）and cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1（CINC-1）in lung ischemia-reperfusion injury of rats.Methods Fifty-four healthy Wistar rats were randomly divided into 3groups：surgical controls（C group），ischemia-reperfusion group（IR group）and intermedin-pretreated group（D group）.At each of 3 time spots（when rats were subjected to 45min of ischemia，then 60min and 120min of reperfusion），6rats from each group were killed to collect plasma sample and the whole right lung.After observing histopathological changes，we examined the wet／dry weight ratio W／D，MPO activity，CINC-1levels and NF-κBp65 protein expression of the lung tissue.Results The lung W／D，MPO activity，protein expression of CINC-1 and NF-κB p65in IR increased progressively and were evidently higher than those of C group（P＜0.05）.However compared with the IR group，preadministration of IMD1-53inhibited the increase of the indexes mentioned above.Pathological examination showed that the IR induced injury was also ameliorated by IMD1-53pretreament.Conclusion Inhalation of IMD1-53could protect against ischemia-reperfusion induced lung injury in rats by inhibiting the infiltration of PMN in the lung possibly through inhibiting the activation of lung NF-κB and the attenuating expression of CINC-1during lung ischemia-reperfusion in rats.

Lung；Ischemia-reperfusion injury；Intermedin1-53；Nuclear Factor-κBp65；Cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1

R322.35R392

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.009

2011-05-09

2011-10-01

山西省科技攻关项目（20090311059-2）

赵卉，女（1970年），汉族，副主任医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）