褪黑素对小鼠MFC前胃癌细胞的survivin、caspase-3表达的影响

刘 卉 宫 喜 徐 丽 蒋继浩 周瑞祥

褪黑素对小鼠MFC前胃癌细胞的survivin、caspase-3表达的影响

刘 卉 宫 喜 徐 丽 蒋继浩 周瑞祥＊

（福建医科大学人体解剖学与组织胚胎学系；神经生物学研究中心，福州350004）

目的 探讨褪黑素（Melatonin，MLT）对小鼠前胃癌细胞（murine foregastric carcinoma，MFC）的生存素survivin和半胱天冬酶-3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，caspase-3）表达的影响。方法 使用不同浓度褪黑素处理培养的胃癌细胞，运用细胞免疫组化、实时荧光定量PCR、免疫印迹法、分光光度法等方法检测褪黑素在抑制小鼠MFC前胃癌细胞增殖过程中对细胞survivin、caspase-3的表达影响。结果 与空白对照组相比，6mmol／L浓度褪黑素干预组的胃癌细胞survivin表达下调，caspase-3蛋白表达上调，并呈剂量依赖性。结论 褪黑素能够降低胃癌细胞survivin的表达，进而激活caspase-3的活性，是褪黑素体外抑制肿瘤细胞增殖的作用机制之一。

褪黑素；胃癌细胞；生存素；半胱天冬酶-3

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，大部分地区仍居恶性肿瘤的发病率和死亡率之首，胃癌不理想的治疗效果主要源于其发病机制尚未明确。生存素survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）家族中分子量最小且结构独特的成员，它特异性高表达于肿瘤组织并通过抑制caspase-3而抑制凋亡，从而有促肿瘤发展作用。Survivin的表达下调可提高肿瘤细胞的凋亡率和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而延缓肿瘤生长［1］。褪黑素主要是由哺乳动物的松果体分泌的一种神经内分泌活性物质，随着对它的深入研究，发现它对预防、治疗肿瘤和延缓其发展有一定效果［2］。本文旨在通过建立褪黑素对胃癌细胞干预模型，运用细胞免疫组化、实时荧光定量PCR、免疫印迹法、ELISA、分光光度法等方法检测褪黑素在抑制胃癌细胞增殖过程中对细胞survivin、caspase-3的表达影响，进一步阐明褪黑素体外抑制胃癌细胞增殖的作用机制。

材料和方法

1.小鼠MFC前胃癌细胞株的培养

小鼠MFC前胃癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院，培养基为RPMI-1640，含10%胎牛血清（Gibco，Invitrogen公司）。用0.25%胰酶消化30sec，每隔3d细胞融合时传代，在37°C，5%CO2的培养箱内培养。

2.实时荧光定量RT-PCR检测褪黑素对 MFC细胞survivin mRNA表达的影响

称取褪黑素 （Sigma公司，MW 232.2）0.0232g，用无水乙醇完全溶解，加入培养基稀释成浓度0.1 mol／L母液。MFC细胞接种于六孔板，密度3×105个／ml，用2，4，6，8，10mmol／L不同浓度的褪黑素干预，并设空白对照组。24h后收集，用Trizol（美国Invitrogen公司）一步法提取总RNA，取RNA 2μg分别逆转录为cDNA。Survivin和GAPDH的序列如下：Survivin （306bp）：F 5′-TGGACAGACAGAGAGCCAAGAA-3′， R 5′-TAGAGCAAAGCCACAAACCCAA-3′；GAPDH （231bp）：F 5′-CCGAGAATGGGAAGCTTGTC-3′，R 5′-TTCTCGTGGTTCACACCCAT C-3′。PCR反应管中加入1μl cDNA，1μl引物对，ddH2O 6.7μl，DYE 0.3μl，2×BrillionⅡSYBR Green PCR buffer 10μl（美国Stratagene公司），总体积20μl，混匀后置荧光定量 PCR仪（美国Applied Biosystems公司，7500型）进行检测。按下列条件反应：95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃延伸1min，共45个循环。应用相对定量的方法进行分析：分析各孔的CT值，根据公式ΔΔCt＝ （Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，算出2-ΔΔCt，用单样本t检验方法分析进行统计学处理。

3.细胞免疫组化定位检测MFC细胞survivin蛋白表达

将清洁的盖玻片置于六孔板中，每孔接种3×105个MFC细胞。细胞贴壁后吸去培养基，用PBS冲洗5min×3，4%多聚甲醛固定20min，PBS洗后滴加3%H2O210min，PBS洗2min×3。滴加一抗survivin（美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶50），室温孵育2h后PBS洗2min×3。滴加试剂1聚合物工作液15min后PBS洗2min×3，滴加试剂2辣根酶标记的抗兔IgG工作液15min后PBS洗2min×3。应用DAB溶液显色20sec，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，中性树胶封片，显微镜下观察。

4.免疫印迹法检测MFC细胞survivin蛋白表达变化

褪黑素体外干预细胞模型同上，24h后收集细胞，加入0.5ml裂解液 （RIPA 强裂解液495μl，PMSF蛋白酶抑制剂5μl）中，提取的总蛋白样品经BCA法测定其蛋白浓度，配置15%SDS-PAGE分离胶与5% 浓缩胶，取40μg蛋白上样，电泳（100 V，1.5h），转膜（100V，45min），转膜后先后与 Western封闭液、抗survivin（1∶200）抗体4℃孵育过夜，再用HRP标记的二抗室温孵育，运用BeyoECL Plus工作液显色，凝胶成像分析。

5.分光光度法检测褪黑素对细胞裂解上清caspase-3浓度的影响

根据检测试剂盒说明书（南京凯基生物技术公司）进行操作，主要步骤如下：用以上浓度褪黑素对细胞干预24h后，收集细胞，PBS洗两次，收集3-5×106细胞数。加50μl细胞裂解液冰上裂解60 min，4℃12000g离心1min，吸上清待测。并用常规BCA法测定其中蛋白浓度。取待测液50μl与50μl 2×反应液混合。加入5μl caspase-3底物于37℃避光孵育4h，405nm波长测光吸收值。通过计算OD诱导剂／OD阴性对照的 倍 数 来 确 定 凋 亡 诱 导 组 的caspase-3活化程度，并以50μl细胞裂解液＋50μl 2×反应液为空白对照组。

6.统计学处理

采用SPSS13.0统计软件，所有数据行单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验进行显著性分析，有关实时荧光定量PCR检测基因水平变化的数据用单样本t检测，均以P＜0.05为有显著性差异。

结 果

1.MFC细胞的survivin蛋白表达

免疫组化染色结果显示，MFC细胞的survivin蛋白表达分布在胞质，核不着色。图A、B、D可见胞质有明显黄色颗粒，图C为阴性对照，可见核被苏术素染成紫蓝色，胞质无黄色颗粒，其中图D显示细胞无苏木素复染。

2.褪黑素对MFC细胞survivin基因表达的影响

Survivin基因主要功能是抗凋亡，实时荧光定量RT-PCR检测结果如图2所示：与空白对照组相比，8、10mmol／L褪黑素组survivin mRNA 表达开始明显下降，差别有统计学意义（P＜0.05）。

3.褪黑素对MFC细胞Survivin蛋白表达的影响

凋亡抑制蛋白survivin由142个氨基酸组成，分子量为16.5kD。免疫印迹法检测结果如图3所示：图A为各组MFC细胞表达的survivin条带。图B显示与空白对照组相比，从6mmol／L褪黑素组起survivin表达明显下降，差别有统计学意义P＜0.05。

4.褪黑素对细胞上清Caspase-3浓度的影响

Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶及终末执行酶，结果如图4所示，MFC细胞用不同浓度褪黑素干预后细胞裂解上清的caspase-3蛋白含量从褪黑素6mmol／L浓度开始上调，并呈剂量依赖性，且差别有统计学意义（P＜0.05）。

图1 MFC细胞的survivin蛋白定位表达。C为阴性对照，D显示细胞无苏木素复染，（A：×200，B.C.D：×400）。Fig.1 Expression and location of survivin protein in MFC cell.C shows negative control，D shows cells were not restrained with hematoxylin，（A：×200，B.C.D：×400）.

图2 褪黑素对细胞survivin mRNA表达的影响。与空白对照组相比，＊P＜0.05。Fig.2 Effect of melatonin on the survivin mRNA expression of MFC cell.＊P＜0.05vs Blank control.

图3 褪黑素对细胞survivin蛋白表达的影响。与空白

图4 褪黑素对MFC细胞裂解上清的caspase-3含量影响。与空白对照组相比，＊P＜0.05。Fig.4 Effect of melatonin on the concentration of caspase-3in the cell culture supernatant（A）and lysate supernatant（B）.＊P＜0.05vs Blank control.

讨 论

大量前期研究证实［3-7］褪黑素体外能够抑制多种肿瘤细胞株增殖，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、骨髓瘤、前列腺癌以及恶性皮肤黑色素瘤细胞株等等。生存素survivin于1997年由Ambrosini等［8］从人类基因库杂交筛选中首先分离得到，它是目前已知作用最强的凋亡抑制蛋白，通过直接抑制caspase-3的活性，从而阻断由各种刺激诱导的细胞凋亡的共同通路。Survivin主要在细胞周期的G2／M期选择性地表达，Li等［9］对survivin转染的 Hela细胞株细胞周期的各时段表达研究发现，它的转录活性在G2／M期增加3.5-5倍，因此survivin是一种具有细胞周期依赖性表达和抗凋亡双重作用的蛋白质。Yao等［10］发现胃癌患者survivin高表达，与其预后不良呈正相关，它的表达下调可增加胃癌细胞的凋亡［11］。Fu［12］等通过向人胃癌裸鼠移植瘤模型注射survivin反义寡核苷酸观察其对胃癌移植瘤的作用，结果发现survivin表达下调并抑制了裸鼠胃癌移植瘤的生长。本课题组前期研究［13］也发现在褪黑素抑制荷胃癌小鼠的移植瘤过程中，胃癌组织中survivin的表达水平下降，表明褪黑素体内具有下调胃癌细胞survivin表达的作用。卢启明等［14］用小干扰RNA沉默人胃癌SGC-7901细胞survivin的表达，结果发现下调survivin可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长。本研究同样也发现褪黑素体外抑制小鼠MFC胃癌细胞增殖过程中，从6mmol／L浓度的褪黑素就能明显下调肿瘤细胞的survivin蛋白表达，而前期研究发现也是从6mmol／L浓度褪黑素组的胃癌细胞G2／M期发生阻滞［15］，可能与survivin表达减少有关。因为survivin过度表达，细胞失去了正常的增殖周期中“凋亡开关”的限制，造成细胞增殖与凋亡平衡打破，最终导致肿瘤的发生。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族caspase家族是一组调控哺乳动物细胞凋亡的蛋白酶，简称半胱天冬酶 （cysteinyl aspartate-specific protease，caspase）。其中caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶，它是细胞凋亡过程中终末执行酶。体外实验证实，caspase-3活化的两条途径都可被survivin抑制，且与胃癌发生发展密切相关［16-17］。正常情况下caspase-3以酶原的形式存在，没有活性，凋亡阶段被激活。活化caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡的发生。分光光度法检测是将caspase-3序列特异性的多肽偶联至发色集团，底物被剪切后，发色集团游离，通过酶标仪检测OD值，观察caspase-3的活化程度。本实验结果发现细胞裂解上清的caspase-3蛋白从褪黑素6mmol／L浓度开始上调，并呈剂量依赖性，与MFC细胞从褪黑素6mmol／L浓度开始出现凋亡，survivin基因表达下调的结果相对应。且本课题组前期研究［18］也发现在褪黑素抑制荷胃癌小鼠的移植瘤过程中，外周血清中caspase-3的表达明显上调。

总之，褪黑素体外抑制小鼠MFC胃癌细胞的增殖过程中，降低MFC胃癌细胞survivin基因的表达，进而激活caspase-3的活性，是褪黑素体外抑制肿瘤细胞增殖的作用机制之一。

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Effect of melatonin on survivin and caspase-3 expression in murine foregastric cancer cells

Liu Hui，Gong Xi，Xu Li，Jiang Jihao，Zhou Ruixiang＊
（Department of Human Anatomy ＆ Histology and Embryology，Neurobiology Research Center，Fujian Medical University，Fuzhou350004，China）

Objective To investigate the effect of melatonin on survivin and caspase-3expression in murine foregastric cancer（MFC）cells.Methods MFC cells were treated with different concentrations of melatonin，and then we used immunocytochemistry，real-time fluorescence quantitative PCR，Western blot，spectrophotometry and other methods to detecte the effect of MLT on the cytokines of survivin and caspase-3expression in MFC cells during their proliferation.Results Compared with the blank control，the 6mmol／L concentration of MLT down-regulated the expression of survivin and up-regulated caspase-3expression in a dose dependent manner.Conclusion MLT can down-regulate the expression of survivin and activate the activity of caspase-3protein in MFC cells，which is one of the anti-tumer mechanisms of melatonin in vitro.

Melatonin；Gastric cancer cell；Survivin；Caspase-3

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.002

2011-04-15

2011-07-10

国家自然科学基金资助（30971541）；福建省科技厅重点项目（2009Y0023）；福建医科大学校苗圃基金资助（2010MP024）。

刘卉，女（1978年），汉族，讲师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressd）