浙江汉族人群HLAⅠ类基因多态性初步分析

戴卫健 李萌 朱发明 严力行

HLA基因具有高度的多态性，在不同地区、不同民族人群中，该基因及单倍型频率分布存在显著的差异。HLA多态性分析有助于提高器官移植供受者间配型成功率［1］。本研究采用PCR测序分型法分析浙江汉族人群HLA-A、B和C位点的等位基因及其单倍型，为非血缘关系器官移植配型、法医鉴定、个体识别等研究积累资料。

1 材料与方法

1．1 材 料

浙江地区健康、无血缘关系的汉族无偿献血者100名，经其知情同意后，采集外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

1．2 方 法

采用血液基因组DNA抽提试剂盒(PEL-FREEZ公司，美国)进行基因组DNA抽提，严格按试剂说明进行操作。紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA纯度和浓度，－20℃保存。然后，扩增HLA-A、B和C基因组全长序列，扩增引物由上海英俊生物有限公司合成，引物序列见表1。扩增反应体系为25μL，其中含10×PCR缓冲液2．5μL，DNA模板约100 ng，LA TaqDNA 聚合酶1．0 U，dNTP、氯化镁溶液终浓度分别为0．2 mmol/L和1．25 mmol/L，引物终浓度为0．3μmol/L。扩增条件为95℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35 个循环;72℃延伸10 min。之后，往每管PCR产物中加入核酸外切酶Ⅰ1μL(2 U)和碱性磷酸酶2μL(10 U)［宝生物工程(大连)有限公司］，在9700型PCR自动扩增仪(ABI公司，美国)上进行酶切，37℃ 30 min，80℃ 15 min，以纯化PCR产物。再以纯化PCR产物为模板，按照BigDye测序试剂盒(ABI公司，美国)操作说明进行双向测序，测序引物序列见表2。测序反应条件为95℃预变性5 min;95℃ 30 s，47℃45 s，60℃ 4 min，35个循环;冷却至4℃保存。测序结果采用Assign 3．5软件进行分析。

表1 HLAⅠ类基因PCR扩增引物序列

1．3 统计学分析

基因频率采用直接计数法计算，单倍型频率计算、Hardy-Weinberg检验均采用 ARLEQUIN 2．0软件分析。

表2 HLAⅠ类基因测序引物序列

2 结果

2．1 人群等位基因Hardy-Weinberg平衡检验

本研究人群HLA-A、B和C经Hardy-Weinberg平衡检验，基因型期望值和观察值差异无统计学意义(P＞0．05)，表明样本具有可信性。

2．2 HLAⅠ类基因的等位基因分布

在浙江汉族人群中，共检出22个HLA-A等位基因，频率较高的等位基因为HLA-A*11:0101(25．5%)、HLA-A*02:0101(13．5%)、HLA-A*24:0201(13．0%)，其中频率大于1%的等位基因有13个，累计频率为95%。共检出42个HLA-B等位基因，频率较高的等位基因为 HLA-B*40:0101(12．5%)、HLA-B*46:0101(10．0%)、HLA-B*58:01(8．5%)，其中频率大于1%的等位基因有25个，累计频率为89．5%。共检出24个HLA-C等位基因，频率较高的等位基因为HLAC*07:0201(16．5%)、HLA-C*01:0201(15．0%)、HLA-C*03:0201(8．5%)，其中频率大于1%的等位基因有17个，累计频率为96%。

2．3 HLAⅠ类基因单倍型频率

共得到HLA-A-B单倍型125种，HLA-A-C单倍型104种，HLA-B-C单倍型122种，高频的单倍型为 HLA-A*33:0301-B*58:01(7．5%)、HLA-A*11:0101-B*40:0101(5．0%)、HLA-A*11:0101-B*15:02(3．5%)、HLA-A*11:0101-C*07:0201(7．0%)、HLA-A*11:0101-C*08:0101(4%)、HLAA*02:07-C*01:0201(3．5%)、HLA-B*46:0101-C*07:0201(3．0%)、HLA-B*13:0201-C*06:0201(2．5%)、HLA-B*46:0101-C*01:0201(2．5%)。

3 讨论

PCR测序分型方法是目前最准确的分辨HLA基因型的方法，可以准确显示HLA基因高变区的全部核苷酸序列。HLAⅠ类基因的多态性位点主要位于第2号和第3号外显子，少数位于第1号和第4号外显子［2］。本研究对HLAⅠ类基因全长进行扩增，然后分别针对第2、3、4号外显子设计测序引物，进行双向测序，对于有歧义的基因型对第1号外显子进行补测。

100名健康、无血缘关系的浙江汉族人群HLAA、B和C位点基因分型的研究结果表明，该人群HLAⅠ类基因的基因多态性较为丰富，HLA-B位点检测到的等位基因数最多，表现出最强的多态性，并且有其自身的独特性。Mack等［3］研究结果显示，在美国白种人群中的高频率HLA-A、B和C位点等位基因为 HLA-A*02:0101(27．5%)、HLA-A*01:0101(14．2%)、HLA-A*03:0101(12．9%)、HLAB*07:02(10．4%)、HLA-B*08:01(9．0%)、HLAB*35:01(6．5%)、HLA-C*04:0101(12．9%)、HLA-C*07:02(11．5%)、HLA-C*07:01(16．1%)，波兰人群HLAⅠ类基因的频率分布与美国白种人群相类似［4］，而与本文资料所示浙江汉族人群不同。浙江汉族人群HLA-A各等位基因的频率分布与韩国人群相似，但HLA-B*15:01较低，而HLA-B*40:0101、HLA-C*07:0201 的频率则较高［5］。与我国其他地区比较，北方(黑龙江、北京、河北、河南)人群HLA-A*33:0301、HLA-A*11:0101、HLA-B*40:0101、HLA-B*58:01、HLA-C*03:0201、HLA-C*06:0201的频率较低［6］，南方(广东)汉族人群HLA-A*24:20、HLA-B*58:01 频率较高，HLA-A*33:03、HLA-A*02:0101较低，而在广东汉族人群中频率较高的HLA-C*07:17在本研究中并未检出［7］。

进一步对浙江人群HLAⅠ类基因的两基因座单倍型及其频率进行分析，共得到351种两基因座单倍型，高频的有 HLA-A*11:0101-B*40:0101、HLA-A*33:0301-B*58:01、HLA-A*11:0101-C*07:0201、HLA-B*46:0101-C*07:0201。而美国白种人群中高频两基因座单倍型为HLA-A*01:0101-B*08:01、HLA-A*03:0101-B*07:02、HLA-B*07:02-C*07:0201、HLA-B*08:01-C*07:0101［3］，日本人群中的高频两基因座单倍型为HLA-B*40:02-C*03:04、HLA-B*07:02-C*07:0201、HLA-B*35:01-C*03:03［8］，均与我国浙江汉族人群不同。与基因频率分布较相似的广东汉族人群比较，浙江汉族人群两基因座单倍型及其频率也存在差异，广东汉族人群的高频两基因座单倍型为HLA-B*40:0101-C*07:0201、HLA-B*58:011-C*07:0201［7］。可见，不同地区和种族人群之间的单倍型频率也有差异。

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