南疆地区青贮玉米中乳酸菌的分离与鉴定

2011-12-10吴书奇史卉玲席琳乔杨丽娟张玲马春晖

塔里木大学学报 2011年4期

吴书奇史卉玲席琳乔杨丽娟张玲马春晖

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

乳酸菌是一类可利用碳水化合物产生大量乳酸的细菌通称［1］。乳酸菌种类很多，目前在细菌分类学上被分为乳杆菌属(Lactobaci llus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串球菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、利斯特氏菌属(Listeria)等30几个属［2］。按发酵过程中的产物不同，可分为同型乳酸发酵菌(同型乳酸菌)和异型乳酸发酵菌(混合乳酸菌)两大类［3］。乳酸菌用途广泛，它令食物美味，并延长保存期，还可以作为保健用品和药品，同时乳酸菌在饲料工业中也起着重要的作用。目前合理利用牧草和作物秸秆是当今家畜饲料学研究的主要课题之一，尤其是在青贮饲料制备这一领域，已经有很多国家如欧盟国家和美国的研究者对乳酸菌在青贮饲料制备中的应用进行了大量深入的研究，乳酸菌在家畜饲养和饲料中有着重要的作用，特别是应用于青贮饲料的调制［2，4］。由于南疆地区气候干燥，降雨量少，不适宜植被生长，牧草缺口比较大，但绿洲区秸秆资源丰富，通过秸秆青贮，充分利用好这些秸秆资源，创造经济效益，将有助于节约粮食资源。本实验目的是从青贮玉米中分离乳酸菌，筛选出pH下降快，产乳酸多的乳酸菌菌株，并且通过形态学、生理生化和分子生物学方法进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

取阿拉尔十团牛场青贮窖玉米秸秆青贮，放入自封袋中扎好。记录采样时间、地点、环境条件等。

1.1.2 试剂

细菌基因组提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒(Bioteke corporation);X －gal、IPTG、琼脂糖;氨苄青霉素、溶菌酶、蛋白酶K(Takara公司);DL2000(西安沃尔森公司);引物由华大基因合成;TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

1.1.3 培养基

MRS培养基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、1.0mL 吐温 80、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾 2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、蒸馏水1 000mL，121℃灭菌20 min，pH 6.2 －6.4，固体培养基加入琼脂15.0 g/L。

LB培养基:蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0g、氯化钠10.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH为7。固体培养基加入琼脂15.0 g/L。

1.1.4 仪器与设备

上海博迅实业有限公司HPX－9162MPE电热恒温培养箱，上海申安医疗仪器厂LDZX－50KB立式压力蒸汽灭菌器，HANNA PH211台式酸度计，Heal Force高速冷冻离心机，金坛THZ－8B汽浴恒温摇床，中科美菱DW－HW318超低温冰箱，博迅SW－CJ－1FD洁净工作台，TECHNE TC－512 PCR仪，DYY－10C型电泳仪，Tanon凝胶成像仪。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选

菌株的筛选与纯化取10 g样品放入液体MRS培养基，室温发酵24 h后，从上清液中吸取1mL液体，加入 9 mL 的无菌水中，梯度稀释 10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，取 10－3，10－4，10－5，涂布于固体MRS平板分离培养基上，37℃培养72 h，观察描述菌落特征，挑取单菌落，在固体MRS培养基继续划线纯化，至少纯化两次，直至出现单菌落，且菌落特征和菌体特征均一为止［5－6］。挑取单菌落在LB液体培养基培养16 h后，储存于30%甘油管中，－80℃低温冰箱冻存。

1.2.2 产酸速率的测定将划线分离菌株接种于装盛有30 mL MRS液体培养基的50 mL三角瓶中，37℃静置培养72 h，测量发酵液的pH值。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 生理生化鉴定

筛选的乳酸菌菌株在MRS培养基上活化24 h后，根据东秀珠，凌代文等介绍的方法，将分离纯化的菌株进行革兰氏染色、接触酶试验，然后按照乳酸菌的属鉴定程序区分乳酸菌不同的菌属［7］。

通过菌落形态、个体形态及生理生化反应结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》中相关分类标准比较，可初步鉴定筛选菌株属种［8］。

1.3.2 分子生物学鉴定

1.3.2.1 乳酸菌分离株菌株基因组的提取，按照试剂盒操作步骤进行基因组提取。

1.3.2.2 引物的序列为 27f:5＇－ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3＇1492r:5＇－GGTTACCTTGTT ACGACTT －3＇

1.3.2.3 PCR 反应产物的检测与序列测定

PCR扩增反应体系为20 μL:10×PCR buffer 2.0 μL;dNTP(2.5 mM)1 μL;Primers(20 μM):Forward 1.0 μL;Reverse 1.0 μL;Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.5 μL;DNAtemplate(50 ng/μL)0.5 μL;加水补至20 μL。反应条件如下:预变性，95 ℃，3 min;变性，94 ℃，1 min;退火，53 ℃，1 min;引物延伸，72℃，1 min20 s，30个循环;延伸，72℃，8 min。16S rRNA的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物上样量为5 μL，电泳缓冲液使用0.5 ×TAE，100 V 电泳30 min，EB(0.5 μg/mL)染色后在紫外灯下观察结果，PCR产物为约1.5 kb大小的电泳条带，凝胶成像仪下观察拍照。

测序工作由天根生化科技(北京)有限公司完成。用NCBI的Blast程序将得到16S rDNA序列与GenBank中已知的16S rRNA序列进行比较鉴定，找出与目的基因序列同源性高的已知分类的菌种，提取其16S rRNA序列，使用软件SeqPup，录入菌株的16S rRNA序列和从GenBank数据库中提取的标准菌株的16S rRNA序列，进行多序列匹配排列，用软件 Mega 4.1 构建系统进化树［9］。

图1 不同菌株的pH值变化情况

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与保存

采用传统的分离纯化方法从青贮样品中共分离出4株菌，菌株分别标记为菌株D、菌株F、菌株J、菌株L，纯化后保存备用。

2.2 乳酸菌产酸速率的测定

通常在实际生产中，青贮饲料发酵初期，迅速降低的pH值可以抑制原料中酵母菌、霉菌以及腐败菌的生长，产酸速率是衡量乳酸菌活力的重要指标。将实验筛选的4个菌株做一个发酵试验，按照3%的接种量转入MRS液体培养基中，37℃恒温培养48 h，观测pH值，初步筛选产酸能力强的菌株。由图1可以看出，发酵48 h后菌株F与菌株J产酸能力最强。淘汰菌株D和菌株L，选择pH值下降快、产酸量多的菌株F与菌株J保留，进行进一步的菌株鉴定。

将纯化好的菌珠F与菌株J接种分别加入高压灭菌的MRS液体培养基，37℃恒温培养，每隔8 h测定其pH值变化。结果发现菌珠F与菌株J在发酵24 h后pH值稳定在4.0以下，适宜于做青贮乳酸菌。

图2 菌株F和菌侏J的产酸速率的测定

2.3 菌株鉴定

2.3.1 生理生化鉴定

菌株F，菌落不透明，白色微黄;经革兰氏染色后在油镜下观察，细胞球形，成链状;菌株F接触酶反应为阳性。菌株J白色，圆形，菌落中央隆起，表面光滑、湿润，边缘整齐;经革兰氏染色后在油镜下观察，菌株J细胞为直杆状，成对分布，菌株J接触酶反应为阳性。菌株F和菌株J均可在盐性条件(6.5%的NaCl)下生长。

2.3.2 乳酸菌菌株16S rRNA序列测定及系统进化树建立

菌株F与菌株J提取基因组后进行PCR扩增，扩增结束后1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在1500bp左右有一条清晰条带，和预期结果一致。

图3 PCR产物电泳图

图4 菌株F与系统进化发育树

经过Blast序列比对，分别挑选与菌株F和菌株J序列同源性在98%以上的标准菌株，构建系统发育树。菌株F和菌株J在系统发育上属于厚壁菌门Firmicutes，芽孢杆菌纲 Bacilli，芽孢杆菌目 Bacillales;菌株F为Staphylococcus;菌株J属于芽孢杆菌科Bacillacea，芽孢杆菌属Bacillus。因此推测菌株F为葡萄球菌属，菌株J为芽孢杆菌属。