脉冲场凝胶电泳在沙门菌鉴定中的应用

楼许柏，马章林

（深圳市宝安区石岩人民医院检验科，广东 深圳 518108）

·检验与临床·

脉冲场凝胶电泳在沙门菌鉴定中的应用

楼许柏，马章林

（深圳市宝安区石岩人民医院检验科，广东 深圳 518108）

目的 探讨脉冲场凝胶电泳（PFGE）在沙门菌分型鉴定中的应用价值。方法 用PFGE方法对一起食物中毒分离出的68株肠炎沙门菌菌株进行分子分型。结果 180份标本经传统生化和血清分型鉴定出的68株肠炎沙门菌，通过PFGE分型后，均产生14条电泳条带，且分子量大小一致。通过BioNumerics软件的数据化处理分析，得到聚类关系树，68株肠炎沙门菌指纹图谱的相似性为100%，与H9812的相似性为65.65%。结论 PFGE是沙门菌分型鉴定的有效手段，可用于细菌性食物中毒传染源的追踪。

脉冲场凝胶电泳；沙门菌；鉴定

我国发生的食物中毒中细菌性食物中毒占30%～90%，其中又以沙门菌食物中毒最常见。由于沙门菌抗原种类多，常规鉴定方法比较困难。近年来分子生物学技术如聚合酶链反应（PCR）、多位点酶电泳、质粒酶切图谱分析等在食物中毒中的应用日益广泛，使得追踪传染源、细菌鉴定、耐药基因的检测等变得更加快速和准确、简洁和快速[1-2]。脉冲电场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是20世纪80年代初出现的一种分离大分子DNA的方法，可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。近年来，核酸脉冲电泳场技术日益成熟，加上采用酶切位点少的限制性内切酶，可分析菌株之间的关系，逐渐形成一套操作简单、分辨率高、标准化、可重复性强的细菌分子分型方法，在院内感染和传染病的流行病学调查中起到越来越重要的作用[3-4]。本项目采用PFGE对我市发生的一起食物中毒的分离菌株进行分型，以期在分子水平上追踪传染源，有效控制食物中毒。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2010年10月我市发生一起职工食堂食物中毒，共采集包括剩余食品，患者的肛拭子、粪便、呕吐物等在内的标本180份。按《食品卫生微生物学检验》方法进行致病菌的分离和鉴定，共分离出肠炎沙门菌68株，菌株进行分批鉴定和低温保存(-80℃，15%甘油)。分子量标准菌株为沙门菌Braenderup血清型全球参考菌株H9812，由中国疾病预防控制中心提供。

1.2 主要仪器和试剂 脉冲场凝胶电泳系统，凝胶成像系统、恒温水浴摇床、紫外蛋白分光光度计。XbaⅠ酶（英国Biolabs公司），蛋白酶K（Sigma公司），琼脂糖（基因公司），TEN缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB），电泳用水经微孔过滤系统纯化。

1.3 方法 采用相同的样品处理方法、相同的菌液浓度、相同的酶切时间和相同的电泳条件对分离出的68株肠炎沙门菌菌株进行分子分型。每次PFGE分型可分析13株菌株，故共作6次PFGE分型。

1.3.1 胶块制备 用普通琼脂平板分离待检菌和H9812，37℃过夜，用无菌棉签刮取适量细菌，悬浮于2ml细胞悬浮液中，波长610nm处调节OD值为1.4左右。取200μl细菌悬液加入1.5ml离心管中，依次加入10μl蛋白酶K溶液(储存液浓度为20mg/ml)、200μl熔化的1%Seakem Gold、1%SDS，室温下混匀后立即倒入凝胶块模具中，静置20min让琼脂糖固化。

1.3.2 蛋白消化 在50ml的聚丙烯螺口盖管上作好标记。每管中加入5ml细胞裂解液，将胶块转入相应标记的管中。54℃水浴摇床（转速150～175r/min）中孵育2h，用纯水洗涤模块2次，TE缓冲液洗涤3次，每次15min，50℃慢速振荡洗涤。

1.3.3 酶切 将模块切成2mm薄片，浸入含XbaⅠ酶50U的200μl酶切体系中，37℃静置3h。

1.3.4 上样 弃去溶液，每管加入0.5×TBE电泳缓冲液200μl，室温放置5～10min。将每株菌的模块薄片直接粘在两边梳子齿上。每块胶放置13个样品和2个H9812。把梳子放入胶槽，从胶槽的下部中央缓慢倒入在55℃～60℃平衡的100ml熔化的1%琼脂糖，室温下凝固30min；小心移去样品梳，去除挡板。

1.3.5 电泳 将胶块放入电泳槽，加入2000ml的0.5×TBE，刚好覆盖胶的表面即可。电压6V/cm，电泳温度14℃，脉冲时间2.2～63.8s，线性转换，电泳时间18h。

1.3.6 染色 电泳结束后，将凝胶放入0.5μg/ml溴化乙锭染色液中，染色30min；再放入去离子水中，摇床上脱色90min。

1.3.7 读胶及数据分析 用Gel Doc 2000拍摄图像，转换成*.tif文件后，用BioNumerics数据库软件对电泳图像进行分析，得出聚类树状图。

2 结果

2.1 菌株的PFGE分型结果 180份标本经传统生化和血清分型鉴定出的68株肠炎沙门菌，通过PFGE分型后，均产生14条电泳条带，且分子量大小一致，片段大小为20～1000kb，6次PFGE实验重复性好（图1）。

图1 肠炎沙门菌的电泳结果

2.2 同源性分析结果 通过BioNumerics软件的数据化处理分析，得到聚类关系树，68株肠炎沙门菌指纹图谱的相似性均完全一致，达到100%，与H9812的相似性为65.65%。

3 讨论

PFGE技术目前广泛应用于细菌的分子分型，美国、加拿大等国家已建立了以PFGE为核心技术的细菌分子分型国家电子网络(PulseNet)，便于各实验室之间通过互联网进行DNA图谱的快速传递与比较，对暴发疫情或散发病例进行实时监测和分析，48h之内便可完成，因而是有效的早期预警的监测手段。PulseNet已经在数起大肠杆菌O157、产单核细胞李斯特菌暴发事件中的传染源、传播途径和流行范围的确定等方面发挥了关键作用[5-6]。

本项目将PFGE技术用于食物中毒病原菌的鉴定分型，确定了引起沙门菌食物中毒暴发的污染源，在疫情的控制方面发挥了重要作用。180份标本经传统生化和血清分型鉴定出的68株肠炎沙门菌，通过PFGE分型后，均产生14条电泳条带，且分子量大小一致，分离的肠炎沙门菌具有完全相同的PFGE图谱，表明是同一克隆的菌株造成了这次食物中毒的暴发。

因为细菌的具有高度的变异性，当判断是否是同一菌株造成的污染时，允许有一定的变异存在。有学者认为PFGE具有85%以上相同条带的菌株可认定是相同的菌株，50%以上的条带不相同时，可认定为流行病学上不相关[7-8]。本项目所有分离的菌株的DNA条带具有100%的相似性，表明是相同来源的菌株。

[1]庞杏林,陈守义,邓志爱,等.重症监护病房医院感染铜绿假单胞菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型[J].中国感染与化疗杂志,2010,10(1):17-20.

[2]Pang JC,Chiu TH,Chiou CS,et al.Pulsed field gel electrophoresis，plasmid profiles and phage types for the human isolates of Salmonella enterica serovar Enteritidis obtained over 13years in Taiwan［J］.JAppl Microbiol,2005,99(6):1472-1483.

[3]苗艳芳,黎 明,李 涛,等.脉冲场凝胶电泳用于副溶血性弧菌的分子流行病学研究[J].中国人兽共患病学报,2010,26(10):935-938.

[4] Sotir MJ,Ewald G,Kimura AC,et al.Outbreak of Salmonella Wandsworth and Typhimurium infections in infants and toddlers traced to a commercial vegetable-coated snack food[J].Pediatr Infect Dis J,2009,28(12):1041-1046.

[5]陈 瑞,熊惠军,宋 立,等.脉冲场凝胶电泳在沙门氏菌流行病学中的应用[J].中国兽药杂志,2010,44（7）:37-39，43.

[6]Kubotak,Barrett TJ,Ackers ML,et al.Analysis of salmonella enterica serotype typhi pulsed field gel electrophoresis patterns associated with international travel[J].J Clinl Microbiol,2005,43(3):1205,1209.

[7]董 晨,庄 菱,钱慧敏,等.2009年江苏省伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳基因分型分析[J].江苏卫生保健:学术版,2010,12（6）:11-12.

[8]Shimono N,Takuma T,Tsuchimochi N,et al.An outbreak of Pseudomonas aeruginosa infections following thoracic surgeries occurring via the contamination of bronchoscopes and an automatic endoscope reprocessor[J].J Infect Chemother,2008,14(6):418-423.

Application of pulsed-field gel electrophoresis in the identification of salmonella.

LOU Xu-bai,MA Zhang-lin.Department of Clinical Laboratory,Shizi Division of People's Hospital of Baoan District,Shenzhen 518108,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the value of pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)in the typing identification of salmonella.Methods PFGE method was used to 68salmonella strains molecular typing identification isolated from food poisoning.Results 68strains of salmonella enteritidis identified by traditional biochemical and the serotyping from 180specimens,after typing by PFGE,14electrophoretic bands were produced,and had the same molecular weight.The data was analyzed by BioNumerics software,clustering trees were obtained.The similarity of fingerprints was 100%in 68salmonella enteritidis,65.65%similarity with the H9812.Conclusion PFGE is an effective means in the typing identification of Salmonella,and can be used to trace the source of infection in bacterial food poisoning.

Pulsed-field gel electrophoresis;Salmonella;Identification

R378

A

1003—6350（2011）15—111—02

楼许柏（1952—），男，浙江省诸暨市人，副主任技师，学士，研究方向：仪器分析。

2011-04-05）