眼镜蛇毒细胞毒素对人肝癌细胞增殖抑制活性及作用机制的研究

王 艳，林礼务，陈志奎，薛恩生，杨 菁，俞丽云

眼镜蛇毒是一类天然毒性物质，含有多种蛋白质、多肽、酶类等，具有广泛的生物学活性。其中眼镜蛇毒细胞毒素(cobra venom cytotoxin，CTX)是眼镜蛇毒的主要成分之一，是一类既具有心脏毒性，又具有细胞毒性尤其是对肿瘤细胞有毒性的组分，在抗肿瘤方面具有一定的应用前景。诱导肿瘤细胞凋亡是许多化疗药物发挥抗肿瘤作用的主要机制。我们采用CTX在体外作用于人肝癌细胞BEL-7404，从分子水平观察CTX对人肝癌细胞的凋亡作用以及对线粒体及细胞质细胞色素C的影响，探讨CTX的抗癌机制，从而为CTX治疗肝癌提供更充足的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝癌细胞系BEL-7404(由福建省肝胆外科研究所惠赠)。

1.1.2 主要试剂 CTX由本研究所从中华眼镜蛇毒粗毒(广州新源蛇毒公司)中分离纯化而得［1］;BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);RPMI 1640培养基、胰蛋白酶(Gibco公司);小鼠抗人Cytochrome C，β-actin单克隆抗体，兔抗人 caspase-3、-9多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗、兔抗小鼠二抗(Santa Cruz公司产品);caspase-3、-9活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所产品)。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖试验与光镜观察 将BEL-7404细胞制备成单细胞悬液，以1×109·L－1浓度接种于96孔板(每孔100 μl)，每孔加入用完全培养基配制成终浓度为0.5、1、2 和3 mg·L－1的眼镜蛇毒细胞毒素200 μl，对照组加入等量完全培养液，每个药物浓度设3个平行孔，药物作用12、24和48 h后，MTT法［2］检测细胞增殖活性，并计算细胞增殖抑制率(%)和半数抑制浓度(IC50)。并在显微镜下观察细胞形态改变。

1.2.2 肿瘤细胞凋亡检测 用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞。收集肿瘤细胞，分3个组，分别为生理盐水组、CTX 1 mg·L－1组和 CTX 3 mg·L－1组，作用时间为24 h。结果判定:凋亡阳性细胞的细胞核出现棕黄色颗粒。400倍高倍显微镜下，随机观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，计算出凋亡细胞的百分率。即凋亡指数(AI)/%=(TUNEL染色阳性细胞数/肿瘤细胞数)×100%。

1.2.3 透射电镜观察 收集分别经对照组及CTX 1 mg·L－1和 CTX 3 mg·L－1处理24 h 的 BEL-7404细胞各1×106个，3%戊二醛固定，2 500 r·min－1离心，去上清，细胞团经1%锇酸后固定、脱水、浸透、包埋、超薄切片、铀－铅复染后，透射电镜下观察。

1.2.4 caspase-3、-9 活性检测 收集分别经 0、1、2和3 mg·L－1的CTX处理24 h的BEL-7404细胞各1×106个，用试剂盒提供的裂解液悬浮，冰上孵育10 min，4 ℃、14 000 ×g离心1 min，收集上清，Bradford法进行蛋白定量，调整蛋白浓度为1×103mg·L－1，取检测缓冲液 80 μl加 caspase-3 或 caspase-9 10 μl，再加入 Ac-DEVD-ρNA(2 mol·L－1)10 μl后混匀，37℃遮光孵育1～2 h，发现颜色变化比较明显时即可测定A405。样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase-3催化产生的ρNA的吸光度。通过标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的ρNA。计算:活化倍数=试验组ρNA值/对照组ρNA值。

1.2.5 Western blot检测细胞色素 C 和 caspase-3、-9蛋白的表达 线粒体/细胞质蛋白提取:分别收集1和3 mg·L－1的CTX处理24 h的BEL-7404细胞，600×g离心5 min，弃上清，细胞沉淀用细胞质提取缓冲液重悬，Dounce匀浆器破碎细胞，700×g离心10 min，收集上清，10 000×g离心30 min，上清液为细胞质成分。沉淀为线粒体成分，用线粒体提取缓冲液重悬，涡旋混合器混合10 s。Bradford法对提取的蛋白进行定量，以40 μg蛋白上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，漂洗后一抗，二抗孵育，洗膜后加入显色剂显色。每个样本重复3次。

2 结果

2.1 眼镜蛇毒细胞毒素抗肿瘤细胞增殖作用 体外培养的人肝癌BEL-7404与眼镜蛇毒细胞毒素孵育后，部分细胞出现皱缩、变圆、脱落(Fig 1A)，随着时间的延长和剂量的增大，坏死的细胞越来越多(Fig 1B)，具有明显的剂量依赖效应和时间依赖效应。而对照组人肝癌BEL-7404却贴壁生长良好，仅个别细胞贴壁能力降低，漂浮起来(Fig 1C)。眼镜蛇毒细胞毒素对人肝癌BEL-7404细胞12、24和48 h 的 IC50分别为 2.56、1.94 和 1.35 mg·L－1，差异有统计学意义(P＜0.05)。见Tab 1。

Tab 1 Cytotoxic effect of CTX on BEL-7404 in vitro ± s，%)

Tab 1 Cytotoxic effect of CTX on BEL-7404 in vitro ± s，%)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs 12 h group;△P＜0.05 vs 24 h group

Concentration/mg·L－112 h 24 h 48 h Control 0.12 ±0.03 0.57 ±0.11 1.21 ±0.17 0.5 15.71 ±2.67* 24.36 ±2.54# 29.42 ±1.87△1 27.85 ±1.87* 39.82 ±1.15# 43.36 ±2.35△2 39.62 ±2.15* 52.37 ±1.65# 61.54 ±1.46△3 57.39 ±2.33* 69.43 ±2.27# 80.32 ±2.33△

2.2 肿瘤细胞凋亡检测结果 生理盐水组TUNEL标记的阳性细胞数较少，AI值为5.3%，给药组TUNEL标记的阳性细胞数增多，CTX 1 mg·L－1组和CTX 3 mg·L－1组 AI值分别为 38.5%和77.8%。

2.3 透射电镜观察细胞凋亡形态学改变 透射电镜下观察对照组细胞细胞核形态规则，细胞膜完整，核仁清晰，染色质均匀分布于细胞核内，胞质内线粒体等细胞器清晰可见(Fig 2A)。给药组大部分肿瘤细胞出现典型的凋亡征象:如线粒体明显肿胀，部分溶解(Fig 2B)，细胞膜皱缩、染色质固缩、核仁裂解为大小不均一的碎块(Fig 2C)。

Fig 1 BEL-7404 proliferation inhibited by CTX in vitroA:BEL-7404 treated for 2 h;B:BEL-7404 treated for 48 h;C:control

Fig 2 Apoptotic morphological changes of BEL-7404 treated by CTX

2.4 caspases酶活性的影响 给药组caspase-3，-9酶活性均有提高，且随着浓度的增加，活化的倍数随着提高，见Tab 2。

Tab 2 Enzyme activity of caspase-9，-3 increased by CTX in BEL-7404

2.5 Western blot检测结果

2.5.1 细胞色素C(Cytochrome C)分布变化 对照组线粒体内Cytochrome C表达较多，CTX组表达量较少，且3 mg·L－1剂量组与空白对照组相比更为明显。而细胞质内Cytochrome C表达则相反，对照组表达较少，CTX组表达量增加，且3 mg·L－1剂量组与空白对照组相比更为明显(Fig 3)。

Fig 3 Expression of cytochrome C proteins in each group

2.5.2 caspase-3、-9蛋白的表达 对照组 caspase-3、-9蛋白仅少量表达，CTX组表达量增多，且3 mg·L－1剂量组与空白对照组相比更为明显(Fig 4)。

3 讨论

细胞凋亡是一种重要生物学过程，是由于内外环境变化或死亡信号触发，在相关基因调控下引起的细胞主动死亡过程。在细胞凋亡机制研究中，目前认为诱导细胞凋亡主要有两条途径:一条是死亡受体途径;另一条是线粒体凋亡途径［3］。线粒体在凋亡早期先于核或染色体的改变即出现结构和功能的变化，已研究证实线粒体膜通透性转运孔(MPTP)开放是细胞凋亡的重要环节［4－5］。在致凋亡因子的刺激下，细胞线粒体跨膜电位降低或丧失［6－7］，线粒体释放细胞色素 C和凋亡诱导因子(AIF)至细胞质中［8－9］，它们可与凋亡相关蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)结合，在有脱氧三磷酸腺苷(dATP)存在的情况下，激活 Apaf-1［10］，活化的Apaf-1可以结合caspase-9酶原而将其切割和活化。caspase-9处于caspase“瀑布式”激活的顶端，导致细胞凋亡过程的启动［11］。活化的caspase-9裂解后可激活caspase-3和下游众多的caspase蛋白酶级联反应。其中caspase-3被认为是级联反应中最关键的效应蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路［12－13］。活化的caspase-3引起caspase级联反应，完成整个细胞凋亡和清除过程，包括DNA片段化、染色体固缩、细胞膜水泡样变、细胞皱缩并向内形成凋亡小体，最终引起染色体DNA及细胞的解体［14］。

Fig 4 Expression of caspase proteins in each group

本研究中证实CTX具有较强的毒性作用，可诱导人肝癌细胞凋亡，且具有明显的剂量依赖效应和时间依赖效应。给药组线粒体明显肿胀，细胞色素C从线粒体释放到胞质增多，提示肿瘤细胞凋亡可能与线粒体参与的途径有关。给药组caspase-3、-9表达增加，酶活性明显增高均提示:caspase-3、-9参与了线粒体凋亡途径。我们认为CTX首先通过线粒体细胞色素C释放，进一步诱导效应性caspase-9、-3蛋白酶激活，最终诱导人肝癌细胞凋亡，这可能是其在体内产生抗肿瘤作用的机制之一。

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