Dicer在肿瘤中的研究进展

中国医科大学附属盛京医院(110001) 王雪梅 王 敏

作者:王雪梅，中国医科大学研究生在读，现工作单位沈阳市妇婴医院。

Dicer是一个相对分子质量约200000的多结构域蛋白质，是miRNA的形成过程中需要作为RNaseⅢ家族成员的一种关键酶。在产生miRNA的生物发育过程中发挥着重要作用。通过与靶mRNA特异的碱基配对，引起靶mRNA降解或者翻译抑制，产生转录后基因沉默。Dicer与肿瘤的关系已在多种肿瘤中得到证实，现就Dicer与肿瘤的研究进展做一综述。

1 Dicer的结构

Dicer是一个相对分子质量约200000的多结构域蛋白质，通常含有6个结构域，它们是:1个RNA解旋酶-DEXH盒子、1个含结合 dsRNA折叠的DUF283、1个结合dsRNA末端的折叠的DUF283、1个结合dsRNA末端的PAZ、2个RIII和1个dsRNA结合结构域。PAZ结构域同时存在于构成RNA沉默复合物的Argonaute(Ago)蛋白质家族中.事实上，PAZ就取名于3个主要的Ago蛋白质，即Piwi、Ago和Zwille。贾第虫Dicer仅有1个PAZ、2个RIII结构域[1]，比哺乳动物Dicer要小得多，但在体外却有正常的裁剪活性。对贾第虫Dicer晶体结构的研究揭示了Dicer制造确定长度小RNA的机制:Dicer的晶体结构外形象短柄斧，2个RIII结构域构成刃部，PAZ结构域构成柄端，之间通过长α螺旋相连，相距约65Å，相当于25ntRNA 的长度[2]。

哺乳动物中只存在一种 Dicer[1]，它同时负责miRNA和 siRNA的产生。其中，miRNA的产生过程首先是pri-miRNA在细胞核内被Drosha-DGCR8复合体切割成60～70nt的pre-miRNA，然后再被细胞质中的Dicer-TRBP复合体切割成为20～22nt的成熟miRNAs，进而调节基因表达。有报道显示，miRNA可以调节大约30%的内源基因的表达[1，3-4]。其中有许多涉及到生物体的生命活动的调节，如生物体的生长发育，细胞的死亡和分化等[5]。在生长发育方面，Dicer通过产生miRNA来调节与血管形成有关基因如let-7family、mir-27b的表达来调控生物体血管的形成，而且在缺乏Dicer的胚胎干细胞在发育早期便发生了死亡的现象，也就进一步证明Dicer在保证生物体的正常生长发育中不可或缺[6-8]。在调节细胞方面，Dicer可以影响细胞的分化，Barbato等[9]发现，在体外培养的小脑颗粒神经元有丝分裂后期分化成神经元和神经胶质细胞的过程中，Dicer表现出优先分配到与细胞分化有关的高尔基体网状结构区域，并在成熟和生长阶段不断地调整分布。Dicer除了影响细胞分化以外还在调节细胞数量方面起着很重要的作用，这可能是通过调节细胞异染色质和着丝粒的形成来完成的，如小雌鼠缺失Dicer的卵母细胞在减数分裂过程中的停滞、无序的纺锤体的出现、染色体配对的缺失，以及在人类无Dicer细胞中，异染色质形成的异常都是很好的证明，加上Chiosea等发现的Dicer在高癌变区域与正常表达水平相比表现出的下调和一小部分癌细胞出现了删除Dicer位点而使Dicer缺失的现象，从另外一个方面证明，Dicer具有控制细胞数量和细胞凋亡的功能[10-12]

2 Dicer与miRNAs

MiRNAs是一类新的、非编码的、内源性小RNAs，长约20～25个核苷酸。可以通过抑制蛋白质翻译、剪切mRNA调节靶基因的表达。它们被命名为微小RNA(miRNA)。这是一类具有调节其他基因表达活性的小RNA。在生物的发育过程中发挥着重要作用。miRNA是内源性的，从编码miRNA的基因转录长链初始miRNA(primiRNA)，分别在核内和胞浆经两步加工形成。miRNAs通过直接剪切靶mRNAs，或者通过完全/不完全与靶mRNAs 3非翻译区互补结合抑制靶mRNAs的翻译。这些靶mRNAs进一步调控多种生物学行为，如发育的进程、干细胞分化 、细胞凋亡、疾病以及肿瘤发生[13-16]。Garcia I研究显示，30% 以上的蛋白编码基因可能成为miRNAs的靶基因，50% 的miRNA位于肿瘤相关基因组的区域或者脆弱的位点[17]，提示miRNA可能在部分肿瘤发生中发挥了重要作用。

miRNA的产生过程首先是pri-miRNA在细胞核内被Drosha-DGCR8复合体切割成60～70 nt的pre-miRNA，然后再被细胞质中的Dicer-TRBP复合体切割成为20～22 nt的成熟miRNAs，进而调节基因表达。首先是初期miRNA复合体(pri-miRNA)被加工成的70个核苷酸的miRNA前体(pre-miRNA)，然后miRNA前体在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成21～25 bp的成熟miRNA。miRNA成熟过程中的连续分裂，需要2个RNaseⅢ:Drosha和 Dicer催化[18]，两者都是特定 dsRNA 的RNA内切酶。Drosha主要存在于细胞核内，有1个dsRNA识别结构域、2个RNaseⅢ结构模体和1个未知功能的末端。

miRNA的形成过程中需要作为RNaseⅢ家族成员的两种酶Drosha和Dicer催化。Drosha主要存在于细胞核内，具有1个双链RNA结合域(dsRNA2binding domain，dsRBD)、2个RNaseⅢ结构域和1个功能未知的氨基酸末端延伸区域。不管pri2miRNA序列及结构如何，Drosha都会将其分裂成70nt的pre2miRNA，但其切割pre2miRNA的机理尚不清楚.Dicer酶包含1个RNA解旋酶结构域、1个 DUF283 结 构 域、1 个 PAZ(Piwi2Argonaute2Zwille)结构域、2个RNaseⅢ域和1个dsRBD。Dicer比RNaseⅢ家族其他成员多1个PAZ结构域，该结构域对酶的功能起着重要作用[19]。

miRNA能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达调控。当miRNA与某一基因同源时，若与该基因mRNA的3，端非翻译区不完全互补结合，此时RISC会阻止该基因mRNA翻译成相应的蛋白质，称之为翻译抑制[20]。若与该基因mRNA完全互补结合，则在RISC核酸内切酶Dicer的作用之下，该基因 mRNA就会被切割降解，达到基因沉默效应，发挥类似 siRNA的作用[21]。miRNA途径可能是使干细胞对外界信号不敏感而导致细胞周期停止在G/S过渡期的其中一个机制。Lee[22]等利用siRNA技术剔除Hela细胞中miRNA生成关键酶Dicer的表达，发现癌基因HMGA2(highmobility group A2)表达明显升高，显示HMGA2表达可能通过miRNA调控，并证实HMGA2在肿瘤发生中的高表达可以通过以下2个途径:1)染色体移位截断HMGA2 3 UTR，导致Let-7的靶标缺失。2)Let-7表达降低。然而，Kanellopoulou[23]等最近证实，缺少Dicer的鼠胚胎干细胞尽管有异染色质不足的现象发生，但并不引起染色体的数目或者结构失常，并且注射这些缺少Dicer的胚胎干细胞到裸鼠中也不会导致肿瘤发生。因此，Dicer在肿瘤发生中的作用可能是非直接的，可能是通过其缺失而导致了具有肿瘤抑制因子效应的miRNAs的减少起作用的。小鼠Dicer基因的缺失研究表明，这个基因在哺乳动物发育和干细胞正常分化、T细胞发育、四肢形成的重要性。

3 Dicer与肿瘤

在miRNA途径中，Dicer的作用至关重要。miRNA序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为mRNA编码蛋白质的调节因子，对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育产生重要影响。最近研究表明，Dicer的表达量的改变与肿瘤的发生有关[24-25]。有文献报道，在对皮肤肿瘤的研究中，miRNA生成过程中的重要酶Dicer和Drosha的失调相对于正常组织是显著的，因而提出miRNA参与了皮肤上皮性肿瘤发生的假说。2005年首次证明人类肺癌中Dicer的表达下调，并指出其表达水平与临床病理特征及预后有密切关系。Karube[26]等发现，Dicer的表达量下降与术后存活期缩短相关。从而表明了Dicer可能阻止肺组织的转化。由于Dicer与异染色质的维持和中心粒沉默有关，其蛋白质水平的降低可能直接导致基因组的不稳定，从而引起肿瘤形成。此外，在前列腺癌、胃癌、原发性肝癌、乳腺癌以及头颈部涎腺癌中均有Dicer表达情况的相关研究，但Dicer在各种肿瘤中的表达并不完全一致。Simion Chiosea[27]等人在前列腺癌中的研究发现，Dicer蛋白在前列腺癌组织中表达水平明显高于良性前列腺增生组织和正常的前列腺组织，而且与肿瘤的分型、分期和肿瘤侵袭性本身密切相关，高表达Dicer的前列腺癌更容易扩散、复发，患者病死率也高，即在前列腺癌中Dicer高表达与肿瘤的转移呈正相关。Zheng Zhihong等[28]报道，在胃癌的发展中Dicer的表达是逐渐下降的，特别是进展期胃癌中，并推测这与miRNA的启动子区甲基化有关，这也证明了Dicer在肿瘤发展中起重要作用。在原发性肝癌的研究中，发现Dicer mRNA在原发性肝癌中的表达量明显下降，Dicer蛋白在原发性肝癌中亦定位于胞浆中，是在胞浆中发挥功能的一种酶。并且可以初步判定Dicer蛋白在肝癌中的表达量是增加的。Chen C[29]等人证实，Dicer基因翻译水平蛋白的变化与转录水平mRNA的变化正好相反，说明在原发性肝癌中Dicer基因在转录水平到翻译水平存在某种调节放大机制或存在其他调节途径，使其蛋白水平放大。在体外细胞的RNAi试验说明，Dicer蛋白在低分化细胞系中的高表达与该细胞的恶性增殖趋势有关，而与HBV在该细胞中的持续复制无关。G Grelier[30]等在对乳腺癌的研究中发现，在人乳腺癌细胞系McF-7中除去Dicer可以阻滞G1期，还可以增加对DNA损伤剂顺铂的敏感性。所以可以应用抗-Dicer方法与传统的化疗去治疗乳腺癌。SI Chiosea等[31]在78例上消化道黏液表皮样癌中研究Dicer蛋白的表达情况，结论为Dicer可以作为低生存率的单变量指标，其异常表达与肿瘤的分化高级别及肿瘤处于晚期有关。Dicer亦是头颈部黏液表皮样癌的独立预后因素之一。

关于妇科肿瘤的研究。Chen等[32]研究发现，促进肿瘤演进和化疗耐药卵巢癌中Dicer的表达与肿瘤临床病理特征呈负相关，预后不良的患者Dicer表达更低。休斯顿德克萨斯大学肿瘤中心William M.Merritt[33]检测了111例患者侵袭性上皮卵巢癌标本中Dicer和Drosha酶的mRNA的水平，并且分析其与临床预后的关系。结果表明，Dicer和Drosha酶的mRNA水平和它们相应的蛋白表达水平是对应的。Dicer的低表达率和肿瘤分期明显相关，Drosha的低表达则与较低的外科(肿瘤细胞减灭术)治疗率有关，分别为:低表达Dicer，较高(恶性)分期的病理特征，对化疗的低敏感性。Dicer和Drosha基因检查却几乎没有发现错配的变异，但是无论出现或不出现变异都与表达水平无关。Pampalakis[34]等研究Dicer在34例卵巢组织中的表达情况，实验得出Dicer胭A在卵巢恶性肿瘤中的表达水平与正常及良性肿瘤的表达水平相比是显著下调的。Nam EJ等[35]阐述，miRNA在复发性卵巢癌中失调的机制，Dicer蛋白在原发及复发的肿瘤之间的表达区别还有待研究。

综上所述，目前Dicer在肿瘤发生发展中的作用以及临床应用价值还不甚清楚，有待更多更深入地研究予以明确。虽然分子生物学技术和信息生物学飞速发展简便了研究，但由于肿瘤发生过程复杂以及作用方式的网络化等均给研究带来挑战，因此探索之旅仍将是一条漫长的科学之路。

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