PreS-Tat真核表达载体的构建及表达*

张 祥，阚全程#，余祖江，王 鹏

1)郑州大学第一附属医院药学部郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052 3)郑州大学护理学院郑州 450001

#通讯作者，男，1963年9月生，博士，教授，主任药师，研究方向:免疫药理，E-mail:sennheiser163@163.com

PreS-Tat真核表达载体的构建及表达*

张 祥1)，阚全程1)#，余祖江2)，王 鹏3)

1)郑州大学第一附属医院药学部郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052 3)郑州大学护理学院郑州 450001

#通讯作者，男，1963年9月生，博士，教授，主任药师，研究方向:免疫药理，E-mail:sennheiser163@163.com

PreS;Tat;乙型肝炎病毒;蛋白转导区

目的:构建pEGFP-PreS-Tat嵌合载体并在真核细胞中表达。方法:提取人乙型肝炎病毒并用PCR法扩增出PreS片段，定向克隆入pEGFP-C3载体，在PreS下游连接合成的Tat序列，构建成功的pEGFP-PreS-Tat质粒经脂质体转染Hela细胞，Western blot鉴定目的蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明成功地构建了pEGFP-PreSTat嵌合载体，Western Blot结果表明该载体能在Hela细胞中表达pEGFP-PreS-Tat融合蛋白。结论:成功构建pEGFP-PreS-Tat载体并表达出相应的融合蛋白，为研究该融合蛋白的功能奠定了基础。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起病毒性肝炎最常见的病原体，全球目前大约有3.5亿慢性HBV携带者［1］，中国HBV表面抗原携带率为9.75%。随着病情的发展，每年有超过100万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化及原发性肝癌等肝脏疾病或相关并发症［2］。然而目前用于肝病治疗的药物如干扰素类、胸腺肽类及核苷酸类似物并不能完全清除HBV。近来肝脏疾病特异性药物与基因治疗已显示出一定的前景，其中目的蛋白的靶向性一直是肝脏疾病药物与基因治疗研究领域的重要研究方向［1］。研制出一种靶向、高效、安全的蛋白是基因治疗的关键。因此作者根据HBV病毒PreS基因和HIV病毒Tat基因的特点构建出具有特异性转运作用的靶向蛋白，为进一步的基因治疗打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和菌株 限制性内切酶HindⅢ、KpnⅠ、BamhⅠ、T4 DNA连接酶和蛋白质Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京全式金公司。Axygen体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒寡核苷酸退火缓冲液购自碧云天生物技术有限公司。鼠抗PreS1和兔抗鼠IgG购自北京博奥森生物技术有限公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。质粒和细胞系pEGFP-C3载体，宿主大肠杆菌DH5α，Hela细胞由郑州大学临床药理研究所提供。

1.2 Tat双链和HBV PreS引物的合成 Tat双链和PreS引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。按照Tat蛋白转导区(protein transduction domain，PTD)48～60位 11个氨基酸(YGRKK RRQRRR)合成编码PTD的片段:上游5’-CTACGG TAGGAAAAAACGCCGCCAGCGCCGCCGCG-3’，下游5’-GATCCGCGGCGGCGCTGGCGGCGTTTTTTCCT ACCGTAGGTAC-3’。使用前用DNA寡核苷酸退火缓冲液做退火处理，退火后得到双链片段。HBV PreS引物:上游 5’-CGCAAGCTTATGGGAGGTTG GTCTTCCAAACCTCGAC-3’，下游5’-CGCGGTACC GTTCGGTGCAGGGTCCCCAGTCCTCG-3’。上下游引物中分别加入HindⅢ和KpnⅠ酶切位点。

1.3 HBV PreS片段的扩增 取已经被确认的HBV感染者的阳性血清，按照病毒提取试剂盒说明提取HBV DNA。依次加入PreS上下游引物进行PCR扩增。反应总体积50 μL。反应条件为94℃3 min;然后进入主循环94℃30 s，55℃ 30 s，72℃60 s，共35个循环;72℃ 10 min，然后收集产物，4℃保存产物。取5 μL，用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析，最后用PCR纯化试剂盒纯化和回收所需要的目的基因片段。

1.4 pEGFP-PreS载体的构建 HindⅢ、KpnⅠ双酶切PCR产物和pEGFP-C3载体，T4连接酶连接，转化感受态细胞后，涂板，37℃培养，挑单菌落常规方法培养，用PreS上下游引物进行扩增，阳性菌落提取质粒为pEGFP-PreS载体。

1.5 pEGFP-PreS-Tat载体的构建 Tat合成产物经PCR仪退火成双链，HindⅢ、KpnⅠ双酶切pEGFP-PreS-Tat载体，T4连接酶与Tat双链连接，连接产物常规方法转化感受态细胞，挑单菌落培养。以PreS上游引物与Tat反义链为引物进行PCR扩增，取阳性反应菌落提取质粒，HindⅢ和BamhⅠ双酶切鉴定。所得质粒送北京三博远志生物技术有限责任公司测序鉴定。

1.6 细胞培养和转染 按Invitrogen的脂质体试剂盒转染操作手册进行细胞转染。取4 μg PEGFPPreS-Tat质粒和10 μL脂质体，分别加入125 μL无血清培养液，平衡5 min后合并溶液，混匀，室温孵育30 min。转染前30 min吸去细胞培养液加入新鲜培养液750 μL，将质粒与脂质体混合物逐渐加入，放入体积分数5%CO2的37℃培养箱中培养，次日更换培养液。

1.7 pEGFP-PreS-Tat蛋白的提取和Western blot鉴定 4℃预冷的PBS洗去培养液，裂解液裂解，提取总蛋白。BCA法测定细胞提取物中蛋白含量，取总蛋白40 μL，加5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min，SDS-PAGE电泳，80 V电压转印至PVDF膜上，将PVDF膜用TBS冲洗，放入30 g/L脱脂奶粉中封闭1 h，TBST洗膜2×10 min，加入鼠抗PreS1(1-500稀释)，4℃过夜。弃一抗，TBST洗膜，加入辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG(1-8 000稀释)，平稳摇动，室温2 h，弃二抗，TBST冲洗，化学发光法显影，暗室压片。

2 结果

2.1 pEGFP-PreS-Tat载体酶切鉴定 结果见图1。经双向测序完全正确，载体构建成功。

图1 pEGFP-PreS-Tat载体酶切鉴定

2.2 细胞转染和pEGFP-PreS-Tat蛋白的Western blot鉴定 见图2。梭形细胞为 Hela细胞。Western blot结果见图3。

3 讨论

该研究中HBV的PreS基因包括PreS1区和PreS2区。Lin［3］等通过实验证明，HBV大分子蛋白的PreS2区参与病毒与肝细胞膜的结合，PreS1蛋白60～108位氨基酸与HepG2的结合密切相关［4］。Miyata等［5］研究证明经过PreS1修饰的大分子物质，可以作为一种肝脏特异给药的无严重不良反应的载体，而同样的载体在人表皮鳞状细胞癌中却并无相应的肿瘤抑制作用。由此可见，PreS1的特殊的导向作用是其作为肝病治疗药物的一个非常好的选择。近些年来，伴随着对PreS2研究的深入，发现其在HBV附着，侵入肝细胞中起着重要作用［6］。其肽段内还包含有T细胞受体，特异性T、B淋巴细胞结合点和Ⅰ、Ⅱ类主要组织相容性抗原(MHC)限制性［7］，还能引起中和抗体和保护性免疫的发生，参与调节HBV引起的细胞及体液免疫［8］。

PTD是近年来发现的一类在蛋白转导过程中，能高效穿过生物膜的结构域，当其与蛋白质、多肽或等分子共价连接时，可将这些分子高效地转移到细胞内。此外还有研究［9］证明，Tat还可以携带核苷酸、脂质体、甚至金属微粒进入几乎所有的组织和细胞，具有速度快，不依赖温度、能量、细胞膜抗体等特性，由于Tat蛋白转运细胞不具有细胞特异性，因此可能为患者带来不可预知的风险。如何提高Tat蛋白在目标细胞中的浓度，是目前Tat蛋白研究的热点。

该研究构建了pEGFP-PreS-Tat载体并成功表达了目的蛋白。该蛋白不仅表达有具有穿透功能的Tat蛋白，还具有肝脏细胞特异性的PreS蛋白。这样的结合一方面满足了治疗性蛋白或者药物向细胞内的运输功能，另一方面由于PreS蛋白能与肝脏细胞特异结合，对于肝脏细胞内药物浓度的提高更有帮助。避免了由于与Tat蛋白的非特异穿透性可能带来潜在的危险。所以，该融合蛋白可以作为药物特异转运入肝脏细胞的良好载体。当然，对于PreS2蛋白来讲，由于其聚合人乳清蛋白结合位点可能与人体内聚合人血清蛋白结合而使PreS蛋白的肝脏特异性受到影响［8］，所以通过基因突变技术避免其聚合人乳清蛋白结合位点的表达可能会使该融合蛋白的肝脏特异性更好地体现出来。融合蛋白发挥其生物效应的重要基础是细胞靶向性，该研究肝脏细胞靶向性蛋白的成功表达为下一步HBV抑制蛋白和肝癌细胞杀伤蛋白的研究打下了基础。

［1］Loomba R，Liang TJ.Novel approaches to new therapies for hepatitis B virus infection［J］.Antivir Ther，2006，11(1): 1

［2］Lavanchy D.Hepatitis B virus epidemiology，disease burden，treatment，and current and emerging prevention and control measures［J］.J Viral Hepat，2004，11(2):97

［3］Lin Y，Liu YX，Cislo T，et al.Expression and characterization of the preS1 peptide of hepatitis B surface antigen in Escherichia coli［J］.J Med Virol，1991，33(3):181

［4］Tang KH，Yusoff K，Tan WS.Display of hepatitis B virus PreS1 peptide on bacteriophage T7 and its potential in gene delivery into HepG2 cells［J］.J Virol Methods，2009，159 (2):194

［5］Miyata R，Ueda M，Jinno H，et al.Selective targeting by preS1 domain of hepatitis B surface antigen conjugated with phosphorylcholine-based amphiphilic block copolymer micelles as a biocompatible，drug delivery carrier for treatment of human hepatocellular carcinoma with paclitaxel［J］.Int J Cancer，2009，124(10):2460

［6］Oess S，Hildt E.Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens［J］.Gene Ther，2000，7(9):750

［7］Yamauchi K，Nakamura T，Yonemitsu H，et al.Possible role of preS2 peptides presented by MHC classⅠantigen in the pathogenesis of chronic hepatitis B［J］.J Hepatol，1993，17(Suppl 3):S6

［8］Madalinski K，Sylvan SP，Hellstrom U，et al.Presence of anti-preS1，anti-preS2，and anti-HBs antibodies in newborns immunized with Bio-Hep-B vaccine［J］.Med Sci Monit，2004，10(1):P110

［9］Eum WS，Choung IS，Li MZ，et al.HIV-1 Tat-mediated protein transduction of Cu，Zn-superoxide dismutase into pancreatic beta cells in vitro and in vivo［J］.Free Radic Biol Med，2004，37(3):339

Construction and expression of eukaryotic vector encoding PreS-Tat

ZHANG Xiang1)，KAN Quancheng1)，YU Zujiang2)，WANG Peng3)1)Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Department of Infectious Diseases，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

3)College of Nursing，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

PreS;Tat;hepatitis B virus;protein transduction domain

Aim:To construct the chimeric vector PreS-Tat and express it in the eukaryotic cells.Methods:After amplifying the HBV PreS gene，the products were cloned into the pEGFP-C3 vector.The synthetic Tat sequences were inserted into the downstream of the PreS.The resultant recombinant vectors were transfected into eukaryotic cell Hela by lipofectamine.Western blot was used to certify the purpose protein.Results:The recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease and sequencing.The pEGFP-PreS-Tat fusion protein was successfully expressed in the Hela cells.Conclusion:pEGFP-PreS-Tat has been constructed and the fusion protein is expressed successfully，which lays the foundation for studying the functions of the protein.

Q784

*国家自然科学基金资助项目 30472031

(2010-10-28收稿 责任编辑李沛寰)