Hela细胞雄激素受体基因外显子1的甲基化检测*

李笑竹，赵贵森，岳阳阳，翟仙敦，艾红伟，薛小琦

河南科技大学法医学院法医物证学教研室洛阳 471003

#通讯作者，男，1972年12月生，博士，副教授，研究方向:分子遗传学，E-mail:lyfy@mail.haust.edu.cn

Hela细胞雄激素受体基因外显子1的甲基化检测*

李笑竹，赵贵森#，岳阳阳，翟仙敦，艾红伟，薛小琦

河南科技大学法医学院法医物证学教研室洛阳 471003

#通讯作者，男，1972年12月生，博士，副教授，研究方向:分子遗传学，E-mail:lyfy@mail.haust.edu.cn

雄激素受体;DNA甲基化;Hela细胞

目的:检测Hela细胞雄激素受体(AR)基因外显子1的甲基化水平。方法:用亚硫酸氢盐克隆测序法和联合亚硫酸氢盐的限制酶法(COBRA)检测不同来源Hela细胞AR基因外显子1的甲基化水平，BiQ Analyzer软件分析测序结果。结果:在非CpG胞嘧啶转化率＞98%的前提下，Hela细胞AR基因外显子1片段的总甲基化率≥96.2%，除第8个CpG位点外，其他CpG位点均为完全甲基化或高甲基化。COBRA法与测序法结果一致。结论: DNA甲基化可能是Hela细胞AR基因失活的分子机制。

Hela是一种感染HPV的宫颈癌细胞株，因为没有内源性雄激素受体(androgen receptor，AR)表达，在激素研究中广为应用［1］。但Hela细胞AR失活的机制尚不清楚。有研究［2］表明，HPV感染的细胞易发生AR基因的甲基化。结合雄激素对女性生殖道上皮的抗增殖作用，作者推测AR甲基化可能参与了HPV相关宫颈癌的发病过程。该研究调查Hela细胞AR基因外显子1的甲基化状态，初步探讨HPV相关宫颈癌细胞AR基因失活的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 不同来源的Hela细胞由华中科技大学同济医学院免疫系、病理系，同济医院妇产科研究室以及河南科技大学医学院病理系分别提供。离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pBS-T PCR产物克隆试剂盒购自TIANGEN公司;低熔点琼脂糖、亚硫酸氢钠和对苯二酚购自Sigma公司;限制酶TaqⅠ和EcoR I购自TaKaRa公司;Acrylamide和Bis-acrylamide为Amresco公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 DNA的提取和修饰 取常规培养、处于对数生长期的Hela细胞，酚-氯仿法提取基因组DNA，紫外分光光度法定量。DNA的亚硫酸氢盐修饰按照Olek等［3］的方法进行:以低熔点琼脂糖包被片段化的变性DNA，5 mol/L亚硫酸氢钠50℃处理4 h，然后顺次以不同的溶液浸泡DNA/琼脂糖小珠达到脱盐、脱磺基和纯化的目的。

1.3 PCR反应 Bisulfite-PCR引物用在线软件Methprimer设计，AR上游引物5’-GTTTAAGGATG GAAGTGTAGTTAGG-3’，下游引物 5’-CCACA AACTTAAAAAAAACCATCCT-3’，扩增片段包含13个 CpG位点，约 300bp(GenBank序列号AL049564)。PCR体系50 μL，含处理后的DNA/琼脂糖小珠1个(约10 μL)，上、下游引物各15 pmol，0.2 mmol/L dNTP，1×PCR buffer，Taq DNA聚合酶1 U。循环参数:94℃预变性5 min;94℃ 35 s、55℃40 s、72℃40 s，37个循环;72℃ 延伸15 min。

1.4 甲基化分析 PCR产物电泳分离后回收目的条带。一部分进行T-A克隆、蓝白筛选，鉴定出10个克隆在PE377循环仪上测序，按亚硫酸氢盐克隆测序法(bisulfite genomic sequencing，BGS)进行分析。另一部分用TaqⅠ和EcoRⅠ酶切，消化产物用琼脂糖凝胶电泳，按联合亚硫酸氢盐的限制酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)进行甲基化分析［4］。

1.5 序列数据分析 将每个克隆的测序结果去除载体和引物后以纯文本格式保存，并与相应的基因组序列文件放在同一目录下。每个片段的序列资料组成独立的数据库。BiQ Analyzer软件［5］调取数据分析，自动报告每个克隆的转化率、CpG甲基化状态，并综合同一片段所有克隆的信息生成甲基化谱。

2 结果

BGS法:每种来源的Hela细胞DNA测序10个克隆，结果均满足BiQ Analyzer软件的默认分析标准。所有样本总的和各个克隆的非CpG胞嘧啶转化率均大于98%，Hela细胞AR基因外显子1片段的总甲基化率≥96.2%(125/130)，除第8个CpG位点外，其他CpG位点都是完全甲基化或高甲基化;第8个CpG位点的甲基化程度用EcoRⅠ酶切法进一步验证(图1)。

COBRA法:Bisulfite-PCR产物(277 bp)可被TaqⅠ完全切断，但只能被EcoRⅠ部分消化(图2)，水解后的片段大小与预期一致(TaqⅠ:212 bp，65 bp;EcoRⅠ:164 bp，113 bp)。变换PCR参数不影响扩增产物的酶切结果。以不同来源的Hela细胞重复实验，所得结果总体不变。

图1 BGS法甲基化分析图谱

图2 COBRA法甲基化分析图谱

3 讨论

AR基因外显子1是启动子CpG岛的一部分。作者用BGS法调查了其中13个CpG位点的甲基化情况，结果显示多数CpG位点在测序的10个克隆中都是甲基化的，而不是正常女性细胞预期的半甲基化。用COBRA酶切法验证第4和第8个CpG位点，与测序结果一致，可以排除克隆偏性。变换PCR参数进行COBRA实验，可以排除PCR偏性，即非甲基化模板优势扩增导致样品呈高甲基化的可能性［6］。以不同实验室保存的Hela细胞重复实验可以排除细胞来源问题。上述结果均支持Hela细胞AR基因外显子1高度甲基化。

AR基因失活在生殖系统肿瘤的发生发展中有重要作用。启动子CpG岛甲基化是AR基因失活的机制之一［7-9］。但对宫颈癌组织AR基因的表达和甲基化情况目前尚缺乏研究。该研究结果显示Hela细胞AR基因外显子1存在高度甲基化现象，说明DNA甲基化可能是Hela细胞AR基因失活的分子机制，从而把HPV感染、AR基因失活、雄激素的抗增殖作用等事实联系起来，为宫颈癌研究提供了一条新的线索。作者正在收集宫颈癌标本，并对Hela细胞AR基因启动子的其他片段进行甲基化分析，希望能进一步证实AR基因甲基化与HPV感染和宫颈癌的关系，为HPV相关宫颈癌的防治提供新的思路。

［1］Benjamin CL，Jenster G，Piedrahita JA.Use of artificial androgen receptor coactivators to alter myoblast proliferation［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2004，91(3):111

［2］Liu L，Zhang J，Bates S，et al.A methylation profile of in vitro immortalized human cell lines［J］.Int J Oncol，2005，26(1):275

［3］ Olek A，Oswald J，Walter J.A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis［J］.Nucleic Acids Res，1996，24(24):5064

［4］Li LC，Dahiya R.MethPrimer:designing primers for methylation PCRs［J］.Bioinformatics，2002，18(11):1427

［5］Bock C，Reither S，Mikeska T，et al.BiQ Analyzer:visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing［J］.Bioinformatics，2005，21(21):4067

［6］Grunau C，Clark SJ，Rosenthal A.Bisulfite genomic sequencing:systematic investigation of critical experimental parameters［J］.Nucleic Acids Res，2001，29(13):E65

［7］Sasaki M，Oh BR，Dharia A，et al.Inactivation of the human androgen receptor gene is associated with CpG hypermethylation in uterine endometrial cancer［J］.Mol Carcinog，2000，29(2):59

［8］Li LC，Carroll PR，Dahiya R.Epigenetic changes in prostate cancer:implication for diagnosis and treatment［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97(2):103

［9］Leader JE，Wang C，Fu M，et al.Epigenetic regulation of nuclear steroid receptors［J］.Biochem Pharmacol，2006，72(11):1589

*广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研项目 Z2009259

Methylation analysis of androgen receptor exon-1 in Hela cells

LI Xiaozhu，ZHAO Guisen，YUE Yangyang，ZHAI Xiandun，AI Hongwei，XUE XiaoqiDepartment of Forensic Biological Evidence，School of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003

androgen receptor;DNA methylation;Hela cell line

Aim:To investigate the methylation level of the androgen receptor(AR)exon-1 in Hela cells.Methods: Methylation analysis of the AR exon-1 was performed by bisulfite genomic sequencing(BGS)and combined bisulfite restriction analysis(COBRA).The sequencing data were analyzed by BiQ Analyzer.Results:At relatively high conversion rate (＞98%)，the methylation ratio of the AR exon-1 was still more than 96.2%.Except for the eighth CpG，all other CpGs under investigations were fully or highly methylated.The results of COBRA were in accordance with that of BGS.Conclusion:DNA methylation may involve in the inactivation of AR gene in Hela cells.

R737.3

*河南省重点科技攻关基金资助项目 082102310097;河南科技大学科研基金资助项目 2007QN013

(2011-03-03收稿 责任编辑徐春燕)