普罗布考对过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激水平的影响*

罗 萍，杜 松，段红艳，李海霞

1)河南省人民医院心内科郑州 450003 2)河南省人民医院检验科郑州 450003

△女，1977年9月生，硕士，主治医师，研究方向:冠心病的基础与临床，E-mail:TJXLLP@163.com

普罗布考对过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激水平的影响*

罗 萍1)△，杜 松1)，段红艳1)，李海霞2)

1)河南省人民医院心内科郑州 450003 2)河南省人民医院检验科郑州 450003

△女，1977年9月生，硕士，主治医师，研究方向:冠心病的基础与临床，E-mail:TJXLLP@163.com

普罗布考;过氧化氢;丙二醛;超氧化物歧化酶;Bax;Bcl-2;凋亡;大鼠;心肌细胞

目的:探讨普罗布考对过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞凋亡的影响，探讨其可能的机制。方法:培养的新生大鼠心肌细胞随机分组，分别给予0、1、10和100 μmol/L普罗布考预处理6 h后，再给予0.2 mmol/L H2O2继续孵育6 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，RT-PCR法检测细胞Bcl-2及Bax mRNA的表达，黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法检测细胞内丙二醛(MDA)含量。结果:普罗布考剂量依赖性地抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡，降低心肌细胞Bax mRNA表达，升高Bcl-2 mRNA表达，升高心肌细胞SOD活性，降低MDA含量。结论:普罗布考可抑制H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡，其作用机制与改善心肌细胞氧化应激水平有关。

心脏受到各种损伤后氧化应激水平显著升高。氧化应激可诱导炎症反应和细胞凋亡，从而导致心室重构和进行性心力衰竭［1］。普罗布考为一种脂溶性强抗氧化剂，能通过细胞膜浸润至心肌细胞内，直接清除细胞内的氧自由基。普罗布考可能通过在细胞内外抑制氧化应激，影响心肌凋亡调控基因，从而减轻心肌细胞的凋亡，保护心功能［2］。作者观察了普罗布考对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 新生1～3 d的Wistar大鼠(郑州大学实验动物中心)。DMEM培养基、新生小牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司);Trizol裂解液(Invitrogene公司);dNTPs、OligodT18、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶(TaKaRa公司)，琼脂糖(Sigma公司);普罗布考(齐鲁制药厂);H2O2(天津广成试剂公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所); AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)。

1.2 乳鼠心肌细胞原代培养 参照Simpson等［3］的方法，采用酶消化法分离心肌细胞进行培养。无菌取出新生大鼠心脏，用无菌D-Hanks液漂洗2次，剪除大血管和心房，再用无菌D-Hanks液洗净心腔血液后，转移至无菌青霉素小瓶中，将心肌组织剪成1 mm3大小的碎块，加入0.6 g/L胰蛋白酶8～10 mL，37℃低速磁力搅拌消化6～8次，每次10 min，直至组织块消化完为止。弃去第1次消化上清液，收集此后的每次上清液，加入37℃预热的含小牛血清的DEME培养基以中和胰蛋白酶，1 500 r/min离心6 min，弃上清。将沉淀用含体积分数20%小牛血清的DEME培养基制成细胞悬液，经贴壁1.5 h除去成纤维细胞分离纯化后，调整为0.5×109L－1接种于培养瓶中，置体积分数5%CO2培养箱中37℃培养。隔日更换培养基，3～4 d后，待细胞融合贴满瓶底且有节律同步搏动时，取原代细胞进行实验。1.3 实验分组及处理 将体外培养的原代大鼠心肌细胞随机分为4组，每组6瓶细胞。H2O2组加入0.2 mmol/L H2O2，其他3组分别予以1、10和100 μmol/L普罗布考预处理6 h后，再加入0.2 mmol/L H2O2继续孵育6 h。

1.4 观测指标

1.4.1 细胞凋亡测定 取4组处理后的心肌细胞用12.5 g/L胰蛋白酶消化，调节细胞浓度为1×106L－1，按AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒说明书操作，经流式细胞仪检测，记录细胞凋亡率。

1.4.2 心肌细胞内SOD活性及MDA含量测定细胞内SOD活性和MDA含量测定分别按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 Bax及Bcl-2 mRNA检测 用Primer 5.0软件设计Bcl-2、Bax和内参照基因GAPDH的PCR引物。引物序列及产物长度见表1。取经过处理的心肌细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，在PCR仪上扩增，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，以目的基因条带与内参条带灰度值的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。

表1 目的基因PCR引物序列及产物长度

1.5 统计学处理 用SPSS 11.5进行统计分析。4组细胞凋亡率、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的相对表达量，细胞内SOD活性和MDA含量的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组心肌细胞凋亡率测定结果 经不同剂量普罗布考预处理后，H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡率均明显下降，且细胞凋亡率随普罗布考剂量的升高而降低，见表2。

2.2 4组心肌细胞Bax及Bcl-2 mRNA的表达与H2O2组相比，不同剂量普罗布考组Bax mRNA的表达均明显下降，而Bcl-2 mRNA表达均明显升高，且呈剂量依赖性，见图1及表2。

2.34组心肌细胞内SOD活性及MDA含量测定结果 与H2O2组相比，普罗布考组细胞内SOD活性均升高，MDA含量均降低，且呈剂量依赖性，见表2。

4组心肌细胞Bax(上)及Bcl-2(下)mRNA的表达

表2 普罗布考对心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

3 讨论

氧化应激是指细胞中促氧化与抗氧化体系之间的平衡失调而倾向于前者所导致的一种细胞内稳态紊乱。促氧化作用主要由活性氧来完成。活性氧包括过氧化氢、单态氧、超氧负离子及羟基等，它们通过多种途径损害心肌组织，包括激活基质金属蛋白酶参与细胞外基质重塑，作为信号分子参与心肌肥厚，诱发心肌细胞凋亡，损伤内皮细胞和激活炎症因子生成等［1］。

已有研究［4］证实活性氧与心肌细胞凋亡密切相关。活性氧主要通过线粒体信号转导通路、P53通路及TNF-α通路引起心肌细胞凋亡。Bcl-2家族是与凋亡密切相关的基因群，它通过调节线粒体膜的通透性和凋亡蛋白的释放调控细胞凋亡。Bcl-2家族被分为两类，一类为前凋亡蛋白，包括Bax、Bad及Bak等，另一类为抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、BCI-XL及BCL-W等［5］。前凋亡蛋白转位到线粒体膜上可促进线粒体内的凋亡蛋白释放。抗凋亡蛋白与前凋亡蛋白结合，可阻止其促凋亡作用［6］。在心肌细胞中，氧化应激能使Bax表达增加，Bcl-2表达下降，线粒体膜通透性增高，促细胞发生凋亡［7］。

Lou等［8］研究显示普罗布考可抑制阿霉素所致扩张型心肌病的心肌细胞凋亡。Ruixing等［9］研究表明普罗布考可减少兔缺血-再灌注损伤的心肌细胞凋亡。Oskarsson等［10］及Kumar等［11］发现普罗布考明显抑制Bax的表达而减少心肌细胞凋亡。该研究结果显示，普罗布考预处理可剂量依赖性地减少H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡率及前凋亡蛋白Bax mRNA的表达，升高抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表达，提示普罗布考可能通过干扰线粒体的致凋亡途径发挥抑制细胞凋亡的作用。作者还观察到普罗布考预处理可剂量依赖性地减少H2O2诱导的乳鼠心肌细胞内MDA含量，提高SOD活性。MDA是脂质过氧化的终产物，是研究抗氧化能力的常用指标之一。SOD是生物体内清除氧自由基的重要酶类，可减轻氧离子损伤，其活性高低可以间接反映体内氧自由基清除能力。这一结果提示普罗布考能有效降低心肌细胞氧化应激水平。提示普罗布考可能通过降低氧化应激水平，从而抑制了心肌细胞的凋亡。

总之，该实验在离体心肌细胞水平观察到普罗布考能有效减少H2O2所致的细胞凋亡，这一效应可能部分通过改善心肌氧化应激水平，干扰线粒体信号转导通路来实现，但作用的具体途径仍未完全阐明，还需进一步探讨。

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［8］Lou H，Danelisen I，Singal PK.Involvement of mitogenactivated protein kinases in adriamycin-induced cardiomyopathy［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288 (4):H1925

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［10］Oskarsson HJ，Coppey L，Weiss RM，et al.Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2000，45(3):679

［11］Kumar D，Kirshenbaum LA，Li T，et al.Apoptosis in adriamycin cardiomyopathy and its modulation by probucol［J］.Antioxid Redox Signal，2001，3(1):135

Inhibition of probucol on cultured neonatal rat cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide

LUO Ping1)，DU Song1)，DUAN Hongyan1)，LI Haixia2)1)Department of Cardiology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003 2)Department of Clinical Laboratory，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003

probucol;hydrogen peroxide;malondialdehyde;superoxide dismutase;Bax;Bcl-2;apoptosis;rat;cardiomyocyte

Aim:To observe the effect of probucol on cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide(H2O2) and to explore its possible mechanisms.Methods:Cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups，and were given 0，1，10，and 100 μmol/L probucol pretreatment for 6 h，respectively，and then induced by 0.2 mmol/L H2O2for 6 h.Apoptosis cells were assessed by flow cytometry.The mRNA expression of Bcl-2 and Bax in cardiomyocytes was determined by RT-PCR.The superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)contents in cells were tested by xanthine oxidase method and color reaction of thiobarbituric acid method，respectively.Results:Probucol decreased cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2and Bax mRNA expression，increased Bcl-2 mRNA expression，increased SOD activity and decreased the MDA content significantly.All these effects were in a dose-dependent manner.Conclusion:Probucol could inhibit cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2partly by reducing the oxidative stress level.

R972

*河南省科技厅基础与前沿项目资助课题 112300410049

(2011-02-11收稿 责任编辑王 曼)