野生黑木耳N56菌株的筛选及生长特性研究

吕玉珍，韦林洪

（扬州环境资源职业技术学院，江苏 扬州 225127）

野生黑木耳N56菌株的筛选及生长特性研究

吕玉珍，韦林洪

（扬州环境资源职业技术学院，江苏 扬州 225127）

从黑龙江东部山区的柞栎木上分离纯化采集到61株黑木耳野生菌株，按照常规育种程序，对这些菌株的性状进行研究比较，结果表明：N56号菌株的纤维素酶活力为4633 U/g，生物学效率为93.7，产量为（42±5）g/袋,菌丝生长速率为5.4 mm/d,其各方面性状皆优于对照菌株（当地普遍推广使用的）黑微29,可作为产业化开发的母种进行推广。

黑木耳；菌株；对照菌株；筛选

木耳营养丰富，含蛋白质、脂肪、钙、碳水化合物、磷、铁、胡萝卜素、维生素，此外含有大量纤维、钾、镁和钠等。美国科学家发现黑木耳能减低血液凝块、肝和冠状动脉硬化，并且能明显地防止血栓的形成。保持黑木耳稳产、维持产品质量的首位关键因素是生产菌株的真确性，不同菌株的生物学效率相差很大，产品的形态特征甚至口感不尽相同。大量菌株的品种退化、老化和不利变异，造成栽培特性和产量的不确定性[1]，一些退化的菌株严重损害了生产者的利益，获得一株优质高产的新菌株势在必行。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

1.1.1.1 母种培养基

马铃薯葡萄糖（PDA）和综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA），参照文献[2]配制。

1.1.1.2 原种和栽培培养基（w/w）

阔叶树木屑78%，麦麸20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量（58±2）%。菌袋尺寸17 cm×33 cm，每袋装干料350 g左右。

1.1.2 菌株

供试菌株系从黑龙江省东部山区呼玛、伊春、东宁、勃利、柴河、尚志、鸡东等32个地点的柞栎木上野生黑木耳或耳木上分离，纯化后保存在锯木屑中，共61株菌株；对照菌株黑微29（当地畅销的主要栽培菌种）。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离方法

将自野外收集到的标本,核对原始序号,标本表面用0.1%升汞消毒,无菌水清洗3次～5次,按无菌操作程序进行组织分离。为便于纯化接种在直径Ф90 mmPDA培养皿上，纯化后移入试管，同时接入盛有木屑的试管内，作为备份[3]。

1.2.2 选育程序

选育工作按常规育种程序进行，即从收集到的野生菌种资源开始，经组织分离、菌种培养、生理性能测定、初筛、复筛、区别性鉴别等，综合评价确定入选菌株。

1.2.2.1 初筛[4]

将分离到的61株野生黑木耳菌种和对照菌株黑微29分别接种在PDA培养皿上，28℃，一起培养，隔日观察生长情况。同时分2批进行拮抗试验。

将保留下来的18株菌株作为原种进行扩大培养。同时配制栽培培基质，严格控制含水量和pH，使用15 mm×28 mm耐126℃高温符合GB 9687-1988《食品包装用聚乙烯成型卫生标准》[4]规定的聚丙烯塑料袋分装，高压灭菌（126 ℃，1.5 h～2 h），冷却，次日接种，每个菌株接种10袋，重复3次。接种后按常规管理，定时观察、记录菌丝萌发、蔓延、原基形成、出耳及环境温度、湿度状况；计算供试菌株的鲜重g/袋、干重g/袋和生物学效率。

1.2.2.2 复筛

将初筛中入选的6株菌株进行活化和扩大培养，制成原种，按初筛的方法进行复筛。每组接种30袋，重复3次，在同一条件下栽培，同时做生化测定以确定N56号菌株的真确性。

1.2.2.3 栽培试验

配制袋栽基质,袋栽的基质为阔叶树杂木锯屑。其中锯屑占78%、糠麸20%、石膏1%和石灰1%，基质含水量60%。菌袋尺寸为17 cm×33 cm，每个菌株接种30袋，样本数量≥30，符合统计学的大样本要求，重复3次。接种后按常规管理，定时观察和记录。产品性状、质量按NY/T749-2003《绿色食品食用菌》[5]进行评价。

1.2.3 培养特征观察

菌丝形态观察系将斜面供试菌种中注入适量无菌水，刮下菌苔并摇匀，吸收0.1 mL菌液于装有PDA培养基的Φ90 cm培养皿上涂布均匀，置于24℃～25℃恒温箱中，隔日观察并测量菌丝蔓延速度，记录生长情况。用Champ Gel全自动凝胶图像处理系统样本并计算出菌丝密度[1]。

1.2.4 生长特性研究

将N56号菌株和黑微29黑微29分别接种在PDA培养基和栽培培养基上,作3次重复。设置10个培养温度（6、10、14、18、22、26、30、34、38、40 ℃），6个初始pH（pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），比较菌丝生长速率。

1.2.5 拮抗实验

将测定菌接种于PDA液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养3 d～5 d。菌悬液离心（12000r/min），取上清，4℃保存备用，用琼脂扩散法[6]，拮抗反应的形态特征隆起型、沟型、隔离型按GB/T12728《食用菌术语》[7]规定的定义判定。

1.2.6 纤维素酶活力测定

对培养袋定期取样，每次取样样本重量相同，均为20.0 g，加40 mL生理盐水，迅速封口，在（40±1）℃水浴中提取酶液，过滤，吸取酶液3 mL，用3，5－二硝基水杨法[8]测定菌丝生长阶段和出茹阶段的纤维素酶活力。

1.2.7 多糖的测定

从栽培场地中取代表性的子实体,去杂后精确称取4.00 g，加少量热水浸泡2 h。反复用滤纸吸干多余水分，加50 mL蒸馏水，进行高压浸提（0.1 MPa，121 ℃）30 min。滤过取清液，用Seveg法去杂质，5倍冰冻乙醇沉淀多糖。用蒽酮比色法在550 nm波长下测定OD值由标准曲线查算还原糖含量[9]。

2 结果和分析

2.1 菌株筛选

2.1.1 初筛

将61株菌株在PDA斜面试管和PDA培养皿上的生长情况于对照菌株黑微29号的生长情况进行比较，结果有35株菌株比对照菌株的生长速度慢，菌丝不够浓密，长势不健壮而被淘汰。拮抗试验的目的是检查各野生菌株上否是独立的菌株，结果有8株菌株因无拮抗现象发生而被淘汰。对入选的18个初筛菌株的生长情况和培养特征进行观察比较，结果见表1。

从表1可以看出，各菌株在菌落形态或菌丝蔓延速度上的特征均不相同。将各菌株的各项指标与对照菌株进行比较,得出的结果是N4、N7、N11、N18、N38、N56等6 株菌株为比较理想的菌株。

2.1.2 复筛

为了比较初筛菌株的培养特征、纤维素酶活力和栽培试验对6个初筛菌株进行了复筛，结果如下。

2.1.2.1 纤维素酶活力的测定结果注:T为用面积生长指数,指在确定的时段内,菌丝在平板上扩展的程度及其与参试菌株的比值;ΔS为菌株生长到12 d和14 d菌落面积之差;t为生长指数,即ΔS/ΔS表示相邻时段净生长面积与参试菌株的比值。菌丝密度类型的定义方法是求出全部参加观察的菌丝密度，求出其平均值和标准差Sd。凡菌丝密度≥Sd＋平均值者定为“密”＜Sd＋平均值者定为“稀”，介于二者间定为“中等”。

表1 菌落的形态特征Table1 The shape characteristics of the fungus community

复筛筛选出的6株菌株的纤维素酶活力，见表2。

表2 6株菌株的纤维素酶活力值Table2 The cellulase activity of 6 strains

由表2证实,菌株的纤维素酶的活力与产量呈正相关。其中N56号菌株纤维素酶活力居参试菌株之首。

2.1.2.2 产量和生物学效率

6株菌株的产量和生物学效率见表3。

表3 6株菌株的产量和生物学效率Table3 The output and bio-efficiency of 6 strains

生物学效率表达菌种对培养基质转化利用能力。复筛试验再次证明，N56号菌株产量（42.2 g/袋）处于首位，生物学效率达到93.7%，远远高于市场上普遍使用的黑微29号菌株的产量。

2.1.2.3 多糖含量

将由6株菌和对照菌株栽培的样品经Seveg法除掉杂质，乙醇沉淀后用蒽酮比色法测定多糖含量[8]，结果如表4。

表4 7株菌株和对照菌株的多糖含量Table4 The polysaccharides content of 7 strains and the control

由表4可以得出，供试野生黑木耳菌株担子果中多糖的平均含量是1659.2 mg/100 g，高于与对照菌株担子菌中中多糖含量（1543.4mg/100 g）。

2.2 N56号菌株的生长特性[10]

2.2.1 形态特征

采用平板观察法。平皿上的菌落生长12 d后，菌丝呈放射状延伸，菌丝密度较大，白色无色素，各平行培养的N56号菌株表现均相同。黑微29号稍有色素，较密，边缘菌丝放射状延伸。N56号与黑微29菌株的菌落形状如图1所示。

2.2.2 生长速度

2种菌株在PDA培养皿上菌落扩展速度如表5所示。

图1 N56号与黑微29菌株的菌落形态Fig.1 The fungus community shape of number N56and Heiwei 29 strain

表5 N56与黑微29号菌株的菌落扩展速度Table5 The fungus community extending speed of N56and Heiwei 29 strain mm/d

由表5可以得出，N56号菌株在PDA培养皿上菌落扩展速度与黑微29号菌株相比，初期菌落扩展速度较慢，说明生长较慢，14 d后，在PDA培养皿上菌落扩展速度迅速加快，达到5.4 mm/d，说明生长急速加速，超过了对照株（5.0 mm/d）在PDA培养皿上菌落扩展速度。

2.2.3 pH与N56号菌株菌丝生长

pH对N56号菌株菌丝生长的影响，见图2。

图2 pH对N56号菌株菌丝生长的影响Fig.2 The effect of pH on N56hypha growth speed

图2直观地说明，N56号菌株菌丝在pH高于4.0时方能萌发，随着pH的升高，菌丝生长加速。在pH＝6.0时，菌丝生长速度最快，超过这一pH，菌丝生长速度大为减缓。由此可知，pH6.0～7.0利于菌丝生长，N56号黑木耳菌丝的适宜PH值为6.0左右。

2.2.4 温度与N56号菌株菌丝生长

温度对N56号菌株菌丝生长的影响，见图3。

图3 温度与N56号菌株菌丝生长关系Fig.3 The relation between temperature and N56hypha growth speed

由图3可知：N56号菌株菌丝在温度高于7℃时方能萌发，随着温度的升高，菌丝生长加速。在25℃～26℃时，菌丝生长最快，超过这一温度，菌丝生长大为减缓。故N56号黑木耳菌丝的适宜生长温度为25℃。

3 结论

在黑龙江东部山区采集分离到的61株野生黑木耳菌种按常规的育种程序，筛选出一株高产菌株，编号为N56号。该菌株的纤维素酶活力为4633 U/g，生物学效率93.7，产量（42±5）g/袋，菌丝生长速度5.4 mm/d，远远高于对照株黑微29号。N56号菌株适宜生长条件为温度25℃、pH6.0。

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Screening of Auricularia Auricular Strains with High Production and the Research of its Growth Characteristics

Lü Yu-zhen，WEI Lin-hong
（Yangzhou Vocational College of Environment and Resource，Yangzhou，225127，Jiangsu，China）

In this study，61 wild Auricularia auricula strains，isolated from quercus oka wood in east mountain area of Heilongjiang province，were sampled.Through conventional breeding procedure，the characteristics of these strains were made further comparison.Results showed that the cellulase activity，bio－efficiency，output and hypha growth speed of number N56strain were 4633 U/g，93.7，（42 ±5）g/bag，5.4 mm/d，respectively.It was also to say that all aspects of this stain were better than the controlled strain Heiwei 29（widely used in local area）.In conclusion，number N56strain could spread as stock strain in industrial production.

Auricularia auricular；strain；controlled strain；screening

吕玉珍（1969—），女（汉），副教授，本科，研究方向：食品科学。

2011-03-02