热处理条件对牛乳中耐热芽孢致死效果的影响

陈霞，黄玉军，王琴，任远庆，顾瑞霞，*

（1.扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏 扬州 225127；2.克拉玛依农牧科学研究所，新疆 克拉玛依 834000）

热处理条件对牛乳中耐热芽孢致死效果的影响

陈霞1，黄玉军1，王琴2，任远庆2，顾瑞霞1，*

（1.扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏 扬州 225127；2.克拉玛依农牧科学研究所，新疆 克拉玛依 834000）

耐热芽孢是引起超高温灭菌乳质量问题的最重要的一类微生物，本研究从不同来源的原料乳中分离并鉴定得到24株耐热芽孢杆菌，经生长特性比较，发现它们的最适生长温度在37℃～42℃之间，并分属5种不同类型；经121℃/10 min和135℃/4 s热处理后，热致死率在58.08%～71.43%之间；经不同热处理方法比较发现，耐热芽孢经85℃/15 s热处理后，37℃保温2 h，再经过135℃/4 s处理，热致死率超过99.99%。

芽孢杆菌；热处理；致死率

芽孢杆菌属（Bacillus）是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌[1]。由于能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学物质有很强抗性的芽孢，可耐受各种不良环境，如可以在pH为2.0～3.0的环境中生存，可以在温度高达80℃甚至以上的条件下生长，南极寒冷的冰雪中也能见到他们的踪迹[2]。

乳中芽孢杆菌（spore-forming bacillus）因能形成耐热性芽孢，故杀菌处理后，仍残存在乳中，这些芽孢都会不同程度的引起乳及乳制品的变质。芽孢杆菌属可以使鲜乳、酸奶中的蛋白质、脂肪分解，相应的会有蛋白质分解产生的腐败味、脂肪分解产生的酸败味，并导致原料乳产气，产酸而变黏稠[3]。

我国幅员辽阔，奶牛饲养条件和管理水平差异很大，导致原料乳质量参差不齐，每年因耐热芽孢灭菌不彻底导致超高温灭菌（UHT）乳等乳产品质量事故损失巨大。因此，有必要对耐热芽孢生长特性及热致死特性进行研究，以便针对不同原料乳特点采用合适的生产工艺条件，降低因耐热芽孢灭菌不彻底而导致产品质量事故引起的损失。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

原料乳：从江苏不同地区牧场收集，其他化学试剂均为国产分析纯。用于芽孢杆菌分离与培养的脱脂乳培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖蛋白胨培养液、T2培养基、蛋白胨水培养液均参考相关文献[2]配制，发酵液体培养基成分参考相关文献[3]配制。

HH-6型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SPX-150BS-II生化培养箱：上海新苗医疗机械有限公司；SW-CJ-IF型超净工作台：苏州净化设备厂；755S型紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；pHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；XSP-8CA生物显微镜：上海永亨光学仪器制造有限公司；SX－500高压灭菌锅：日本TOMY公司等。

1.2 方法

1.2.1 耐热芽孢的分离

将新鲜原料乳加热到100℃，保温10 min，冷却到46℃，用灭菌移液管吸取0.1 mL样品于灭菌培养皿中，倾注营养琼脂培养基，并转动培养皿使之混匀，待凝固后，翻转板置于（42±1）℃的培养箱中培养48 h～72 h。挑取单个菌落并进一步分离纯化，并在4℃冰箱中冷藏保藏[4]。

1.2.2 耐热芽孢的鉴定

对分离出的耐热芽孢先进行革兰氏染色和耐热芽孢镜检[5]，然后进行糖发酵试验、VP试验、淀粉水解试验、吲哚试验等生理生化试验[6]，对分离出的耐热芽孢菌进行鉴定。

1.2.3 耐热芽孢总数的测定

用营养琼脂培养基倒平板于（42±1）℃培养48 h～72 h后计数。

1.2.4 耐热芽孢生长曲线测定[7]

用紫外分光光度计测定培养物的OD540值。

2 结果与讨论

2.1 耐热芽孢的分离、鉴定与生长发育特性分析

从江苏不同规模的8个牧场共计取12个奶样，经分离并鉴定获得24株耐热芽孢。将分离获得的24株芽孢菌的生长特性进行比较，他们的最适生长温度介于37℃～42℃之间。其中5株最适生长温度为37℃，19株最适生长温度为42℃。对生长曲线进行测定发现，24株耐热芽孢归于5种不同状况，如图1所示。

从图1可以看出，5种芽孢杆菌均在0 h～8 h处于延缓期；YN12在8 h～40 h处于对数期，40 h～48 h处于稳定期，48 h后进入衰亡期；YN15在8 h～32 h处于对数期，32 h～48 h处于稳定期，48 h后进入衰亡期；YN23在8 h～40 h处于对数期，40 h后经过短暂的稳定期进入衰亡期；YN22在8 h～40 h处于对数期，40 h～48 h处于稳定期，48 h后进入衰亡期；YN32在8 h～32 h处于对数期，32 h～40 h处于稳定期，之后进入衰亡期。

2.2 不同芽孢的耐热特性比较

对24株耐热芽孢分别经85℃/15 s、121℃/10 min和135℃/4 s热处理后的热致死率见表1。

由表1可以看出，85℃/15 s的热处理对菌体的致死率在0.38%～3.93%之间，说明85℃/15 s的热处理对耐热芽孢的致死率效果很差；121℃/10 min热处理对耐热芽孢的致死率在58.08%～70.80%之间；135℃/4 s热处理对耐热芽孢的致死率在60.47%～71.43%之间。

2.3 不同热处理方法对芽孢致死率的影响

对5株耐热芽孢杆菌先采用85℃/15 s热处理后，然后在4、8、37和42℃4种温度条件下保温不同的时间后，再经135℃/4 s灭菌处理，各处理后的致死率如表2。

由表2可以看出，含耐热芽孢的原料乳先进行85 ℃/15 s杀菌，然后置于4、8、37和42℃4种温度条件下进行激活，再对其进行135℃/4 s灭菌处理后，耐热芽孢杆菌致死率明显提高，尤其是经过37℃和42℃培养处理的芽孢杆菌，再经过135℃/4 s热处理后热致死率明显高于4℃和8℃。其中原料乳经85℃/15 s处理，于37℃保温2 h，再经135℃/4 s的热处理后，耐热芽孢菌的致死率超过99.99%以上。

3 结论

本实验从江苏不同规模牧场的12个奶样中共分离得到24株芽孢杆菌，经生长特性比较发现，分属5种不同生长类型，且这5种不同类型耐热芽孢的耐热特性亦有所区别。不同耐热芽孢经121℃/10 min及135℃/4 s热处理后的热致死率在58.08%～71.43%之间。进一步研究发现，将含耐热芽孢的原料乳先经85℃/15 s杀菌后，再采用37℃培养2 h后，经135℃/4 s热处理，热致死率均超过99.9%。可能是因为芽孢杆菌在最适生长温度下（37℃）更有利于出芽繁殖，因此再经灭菌处理大大提高其致死率。

表 2 对5株芽孢杆菌进行不同热处理后的致死率Table 2 The death rate of five heat-resistant bacillus after different heat treatment %

[1]韩永霞.牛乳中芽孢杆菌的动态变化及部分生物学特性的研究[D].内蒙古:内蒙古农业大学,2006(5):6-8.

[2]R.E.布坎南,N.E.吉本斯等.伯杰细菌鉴定手册[M].科学出版社,1984:729-730

[3]叶鸿剑,王鑫,周银贞.乳中芽孢杆菌对乳制品的危害及其检测方法的研究[J].科技资讯,2006(17):150

[4]刘莹,孙容丹,杨翔华，等.5株芽孢杆菌的分离鉴定、拮抗性试验与抑菌效价测定[J].中国农学通报,2006(5):32

[5]周德庆.微生物学教程[M].北京:北京教育出版社,1996:198-200.

[6]张刚.乳酸细菌—基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2007:2-20

[7]梁俊芳,靳烨.原奶中芽孢杆菌生长曲线的分析研究[J].中国乳业,2008(5):56

Influence of Different Heat-treatment Conditions on the Lethal Effect of Heat-resistant Spores in Milk

CHEN Xia1，HUANG Yu－jun1，WANG Qin2，REN Yuan－qin2，GU Rui－xia1，*
（1.Jiangsu Key Laboratories of Dairy Biological Technology and Safety Control，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2.Institute of Agriculture and Farming Science and Technology of Kelamayi；Kelamayi 834000，Xinjiang，China）

Heat－resistant spores is one of the most important microorganisms causing the quality problems of UHT milk.In this paper，24 heat－resistant bacillus were isolated and identified from different raw milk.Through the growth characteristics comparison，they could be divided into five different types and the most suitable growth temperature was between 37℃ and 42℃.After 121℃/10 min and 135℃/4 s heat treatment，heat death rate of heat－resistant bacillus was between 58.08%and 71.43%.Compared with the different heat treatment conditions，the bacillus treated under 85℃/15 s，incubated under 37℃/2 h，and then treated under 135 ℃/4 s，the heat death rate of bacillus was more than 99.99%.

bacillus；heat treatment；death rate

国家自然科学基金（30871815）；江苏科技支撑计划（BE2008357）

陈霞（1976—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：乳品科学。

*通信作者：顾瑞霞（1963—），男（汉），教授，博士，研究方向：乳品科学。

2011-12-29