牛胎盘废弃物制备食品微生物培养基

沈棚，牟德华 ，李艳，叶润

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

牛胎盘废弃物制备食品微生物培养基

沈棚，牟德华*，李艳，叶润

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

采用废弃牛胎盘下脚料为氮源制备新型培养基。并采用Plackett-Burman法、最陡爬坡试验和响应面试验（Box-Behnken设计法）相结合的方法对大肠杆菌培养基进行优化。结果表明：牛胎盘下脚料经水解后，替代LB培养基中的酵母浸粉，显示出较高的生长水平。优化后的新型培养基（NTP）组成为：葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L，胰蛋白胨10.3 g/L，牛胎盘水解物16.7 g/L，pH 7.85，最终得到活菌数量较高的培养基配方。

牛胎盘；培养基；响应面；优化

胎盘在中医药学中称为紫河车，是哺乳类胎生动物在怀胎时为胎儿供应养分，促进胚胎生长的特殊组织。它作为妊娠期间母体与胎儿进行物质交换的纽带，具有重要的生理功能，可分泌多种激素、酶类；其组成成分复杂，含有多种蛋白质、抗体、磷脂、生长因子、细胞因子及能刺激抗体免疫系统的小分子活性物质[1-2]。目前关于牛胎盘在食品或食品用微生物培养方面的应用研究较少，主要研究为提取其中少量的活性因子[3-4]。而剩余的大部分下脚料仍含有较高的蛋白质，一直作为废物丢弃，既污染环境又浪费蛋白质资源。

响应面分析方法，由一组数学和统计学方法组成。可用于确定各因素及其交互作用在加工过程中对非独立变量的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系。可快速有效地确定多因子系统的最佳条件[5]。本试验利用牛胎盘下脚料废弃物，经水解浓缩后，为微生物提供优质的氮源，制备新型培养基（NTP培养基），不仅降低了成本，还有很高的经济利润，为畜牧业增加副产值。进一步通过响应面设计优化大肠杆菌培养基，以期获得活菌数量较高的培养基配方。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

大肠杆菌E.coliK12：河北科技大学微生物研究室保藏菌种。

1.1.2 培养基（质量分数）

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，pH 7.0；

NTP培养基：胰蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，牛胎盘水解物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0。

1.1.3 试剂

复合蛋白酶：和氏璧生物技术有限责任公司；牛胎盘：河北君乐宝乳业有限公司提供。

1.2 仪器

YPW-I型迴转式恒温调速摇瓶柜：上海通特电讯电设备厂；YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-GJ-1BU洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅：河南省巩义市英峪予华仪器厂；UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理工艺

牛胎盘下脚料→烘干、粉碎→复合蛋白酶水解（加酶量 5000 U/g，温度 53 ℃，pH6，料液比 1:10，水解2.5 h）→离心→牛胎盘水解液→浓缩→4℃冷藏

1.3.2 检测方法

试验采用比浊法测定培养液OD值。比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度（即OD值），用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量[6-7]。

测定方法：每隔一定时间间隔取样摇匀，将大肠杆菌培养液进行适当稀释，使光密度在0.1～0.65之间，以没有接种的空白对照组液体培养基调零点，在600 nm波长，1 cm比色杯中依次测定OD值，以光密度（OD值）为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。

1.3.3 培养条件

种子培养条件：250 mL三角瓶装种子培养基50 mL，接斜面活化后的种子一环，37℃，180 r/min，旋转振荡培养18 h。

发酵培养条件：250 mL三角瓶装发酵培养基50 mL，按照2%的接种量接种后在37℃，180 r/min，旋转振荡培养24 h。

1.3.4 优化方法

Plackett-Burma设计：本试验在前期单因素试验的基础上选用N=12的Plackett-Burman设计法，对培养基的5个因素的重要性进行考察，每个因素取高低2种水平，以培养液的OD600为响应值，试验设计见表1。用minitab15软件对试验数据进行处理，比较各因素重要性。

最陡爬坡试验：根据Plackett-Burman试验结果，以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路径（包括变化方向和变化步长），快速的逼近最大响应区域。而其他因素的取值则根据正效应因素均取较高值，负效应因素均取较低值的原则。找到下一步响应面分析的中心点。

Box-behnken设计：响应面分析实验方法根据PB试验设计和最陡爬坡试验结果，以最陡爬坡试验得出中心点，设计三因素三水平的优化试验。用minitab软件设计Box-Behnken响应面实验并进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 NTP培养基试验结果

分别采用NTP新型培养基和LB培养基培养大肠杆菌的生长曲线如图1所示。

图1 NTP培养基培养大肠杆菌生长曲线Fig.1 The growth curve of E.coli cultured by NTP medium

由图1可知，当采用相同含氮比例的牛胎盘水解液代替LB培养基中的酵母浸粉时，NTP新型培养基最终活菌含量略高于LB培养基，其原因是牛胎盘下脚料的蛋白水解液中，含有一定的活性多肽，有利于微生物的生长，表明采用NTP培养基适合于大肠杆菌的培养。

2.2 大肠杆菌培养基优化

2.2.1 影响因素的筛选

按照Plackett-Burman设计，在培养稳定期时取样测定600 nm条件下的OD值，Plackett-Burman试验设计及结果见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果Table 1 Design and results in Plackett-Burman experiment

对表1进行回归分析，所得结果列于表2。

表2 各因素水平、效应值及显著性分析Table 2 Factors，levels，effects of value and statistical analysis in Plackett-Burman experiment

由表2可看出，胰蛋白胨、牛胎盘水解物、pH、表现为正效应，氯化钠、葡糖糖表现为负效应。可信度大于85%的因素为胰蛋白胨、牛胎盘水解物、pH，其中胰蛋白胨、牛胎盘水解物的可信度大于90%，影响显著。因此确定胰蛋白胨、牛胎盘水解物、pH为主要影响因素进行下一步试验。

2.2.2 最陡爬坡试验

根据表2分析结果确定不显著因素的水平，表现为正效应因素取较高值，表现为负效应因素取较低值，安排如下:葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L。显著因素的变化步长及方向的试验计及结果见表3。

从表3可看出，最佳因素浓度处于第4组与第5组实验之间，第4组产量最高，因此以第4组的水平作为响应面实验的中心点，即胰蛋白胨8 g/L，牛胎盘水解物 14 g/L，pH7.7。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and results in the steep hills experiment

2.2.3 Box-Behnken试验设计及结果

通过最陡爬坡试验确定了重要影响因素的取值区间。以胰蛋白胨、牛胎盘水解物及pH 3个重要因素为自变量，各因素编码水平如表4所示。Box-behnken试验设计及结果如表5所示。

表4 Box-Behnken设计的变量及水平Table 4 Variables and levels in Box-Behnken design

表5 Box-behnken设计及结果Table 5 Design and results in Box-Behnken

对试验结果进行回归拟合，得到回归方程为:Y=-88.22-327.68X1-374.32X2+24.60X3-7683.17X12+2921.08X1X2+55.64X1X3-2.2457X22+80.19X2X3-1.69X32回归方程的方差分析见表6。

从表6可以看出，模型是显著的（P=0.002），失拟项p=0.063，表明失拟不显著，方程的相关系数R2为0.9719，调整后的R2为0.9212。表明模型能解释92.21%菌量的变化，回归拟合程度较好，可以用此模型对培养液的活菌含量进行预测。

表6 回归方程的方差分析Table 6 The variance analysis of regression equation

2.2.4 最佳浓度的确定及验证实验

对回归模型进行响应面分析，得到各响应面立体分析图，见图2～图4。

图2 Y=f(X1，X2)的响应面立体分析及其等高线图Fig.2 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X1,X2)

图3 Y=f(X1,X3)的响应面立体分析及其等高线图Fig.3 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X1,X3)

从图2～图4中可看出，两两因素间存在比较明显的交互作用，最佳点落在实验考察的区域内。

由图及软件分析可知，回归方程存在稳定点。当X1，X2，X3分别为：10.3、16.7 和 7.85 g/L 时，响应值 Y达到最大值3.53，即培养液的活菌含量最高。所得的实际培养液OD600平均为3.49，与预测值接近，可见该模型能较好的预测实际情况；而在未优化培养基条件下的培养液OD600=1.995，可见优化后的培养基能显著提高培养液中的活菌含量。

图4 Y=f(X2,X3)的响应面立体分析及其等高线图Fig.4 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X2,X3)

3 结论

以牛胎盘下脚料为原料，经蛋白酶水解后，制备新型NTP培养基，用于大肠杆菌培养，可明显提高活菌数量，从而实现了废弃物再利用。

通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验及Box-behnken设计的方法确定大肠杆菌培养的最适培养基为：葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L，胰蛋白胨10.3 g/L，牛胎盘水解物16.7 g/L，pH 7.85。进一步研究NTP培养基在其他微生物发酵培养中应用，用牛胎盘下脚料水解物替代酵母浸粉能够在微生物的大规模培养中提供质优的生长因子，具有很好的应用前景。

[1]李鲁龙，刘月文.牛胎盘营养成分的分析[J].中国乳品工业，2000，28(2):39-40

[2]高丽英，尚海忠，张寿，等.高原牦牛胎盘营养成分的测定与分析[J].畜牧与饲料科学，2009，30(1):31-32

[3]牟德华，李艳，赵玉华.牛胎盘生物活性物质的研究进展[J].河北工业科技，2006，23(3):120-123

[4]房新平，生庆海，王玉良，等.酶法水解牛胎盘下脚料[J].中国乳品工业，2005，33(3):35-38

[5]Xin-ping Fang,Wen-shui Xia,Qing-hai Sheng,et al.Purification and characterization of animmunomodulatory peptide from bovine placentawater-solubleextract[J].PreparativeBiochemistry&Biotechnology，2007,37(3):173-184

[6]刘志祥，曾超珍.响应面法在发酵培养基优化中的应用[J].北方园艺，2009(2):127-129

[7]饶可扬.《大肠杆菌生长曲线测定》实验方案的改进[J].大连教育学院学报，1995(1):109-110

[8]张丽靖，陈志良，杨郁.纳豆菌体外抑制大肠杆菌的培养基优化[J].2009，19(1):41-42

Using Bovine Placenta Scraps to Prepare Food Microbiology Medium

SHEN Peng,MOU De-hua*，LI Yan,YE Run
（College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Bovine placenta scraps were used as a new nitrogen source for a new medium in this study.Plackett-Burman method,steep hills test and responses surface（Box-Behnken design）method were adopted to optimize the culture medium of the E.coli.Results showed that the E.coli had a higher growth level,after hydrolysis of bovine placenta scraps,which,thereafter,replaced yeast powder immersion in LB medium.The new optimized medium（NTP）was composed of glucose 2.8 g/L，NaCl 11 g/L，tryptone 10.3 g/L，bovine placenta hydrolysis content 16.7 g/L，pH 7.85.A medium formula with greater living bacterium content was achieved Eventually.

Bovine placenta；medium；responses surface methodology；optimization

河北科技大学生2010年度大学生科技创新基金项目（10253）

沈棚（1987—），男（汉），在读本科生，研究方向：天然产物的分离研究。

*通信作者：牟德华（1960—），男，教授，主要从事农产品深加工以及天然产物分离的研究。

2010-08-30