夏枯草总黄酮超声提取工艺

阳元娥，谭伟

（1.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300；2.广东工业大学，广东 广州 510006）

夏枯草总黄酮超声提取工艺

阳元娥1，谭伟2

（1.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300；2.广东工业大学，广东 广州 510006）

研究超声波辅助提取夏枯草总黄酮的最佳提取工艺条件。考察乙醇浓度、料液比、提取温度、超声功率及提取时间对夏枯草总黄酮提取率的影响，并在此基础上采用响应面分析法对提取工艺进行优化。以上因素对夏枯草总黄酮的提取率都有一定的影响，最佳提取工艺条件如下：乙醇浓度为60%；料液比为1:12（g/mL）；提取温度为61.4℃；超声功率为150 W；提取时间为40 min。在此条件下，夏枯草总黄酮的提取率可达到7.92%。

超声波；夏枯草；黄酮；提取；曲面响应

夏枯草，学名Prunella vulgaris L.，为唇形科夏枯草属植物夏枯草的干燥果穗，一般取其干燥果实入药。夏枯草是一种疗效确切的常用中草药，其有效成分黄酮类化合物具有重要的药理作用和保健功能[1]，在制药、食品、日用化工等行业具有广泛的用途。夏枯草主要含有三萜及其苷类、黄酮类、甾醇及其苷类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分。黄酮的传统提取方法有水提法[2]、有机溶剂提取法[3]，新型提取方法有微波法[4]、超声波法[5-6]和超临界流体萃取法[7-8]等。本研究采用操作方便、成本低廉的超声辅助法提取夏枯草总黄酮，并对其工艺进行了优化。

1 材料与设备

夏枯草生药材：市售，经鉴定为唇形科植物夏枯草的干燥果穗。芦丁对照品：购于中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠：汕头光华化学厂生产；硝酸铝：广州化学试剂厂生产；氢氧化钠：洛阳市化学试剂厂生产；其他为分析纯。

KQ3200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司生产；DF-20型流水式高速中药粉碎机：温岭市大德中药机械有限公司生产；RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂生产；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司生产；1201型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司生产；电子天平：上海精天电子仪器有限公司生产。

2 方法

2.1 芦丁标准曲线绘制[9]

精密称取于芦丁标准品20.0 mg，用60%乙醇（体积分数，下同）溶解，并完全转入100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容定容后摇匀，得0.200 mg/mL的芦丁标准溶液。分别吸取上述芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用 60%乙醇补至约5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，放置5 min后加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，摇匀，放置6 min后再加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀，用60%乙醇补足至刻度，放置15 min后在510 nm处测定其吸光值。以质量浓度对吸光值作图，得到标准曲线（见图1）。以浓度与吸光值进行线性回归。得到回归方程A=11.5167 C+0.032[A为吸光度，C为浓度（mg/mL）]，相关系数为r=0.9964。根据标准曲线则可计算出提取液中黄酮的含量。

2.2 黄酮含量测定方法

吸取待测液1 mL，加入到10 mL的容量瓶中，用60%乙醇补至约5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，放置5 min后加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，摇匀，放置6 min后再加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀，用60%乙醇补足至刻度，放置15 min后在510 nm处测定其吸光值，用空白试剂作参比，得夏枯草总黄酮的吸光值。

2.3 提取实验操作

准确称取过40目筛的夏枯草2.0 g，加入到100 mL的三颈烧瓶中，加入不同浓度的乙醇溶液，放置到水浴恒温槽中进行超声作用，调节提取温度和超声波功率，在不同的提取时间内进行超声提取夏枯草总黄酮实验。在固定其他参数的情况下，分别考察了乙醇浓度、液料比、超声功率、超声提取时间以及超声提取次数对夏枯草黄酮萃取率的影响。在单因素试验的基础上，进行响应面Box-Behnken设计，以总黄酮提取率为响应值，通过响应面曲面分析（Response surface analysis，RSA）对提取工艺条件进行优化。

3 结果与讨论

3.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

在料液比 1:10（g/mL）、提取温度 60 ℃、超声波功率150W、超声处理时间30min，考察乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时总黄酮提取率变化，结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由图1可见，当乙醇浓度为60%时，夏枯草总黄酮的提取率最高，再低于或高于此乙醇浓度，提取率都下降，因此，乙醇浓度以60%为宜。

3.2 料液比对总黄酮提取率的影响

根据3.1结果，选择乙醇浓度为60%、提取温度60℃、超声波功率150 W、超声处理时间30 min，考察料液比分别为 1:8、1:10、1:12、1:14、1:16（g/mL）对总黄酮提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ration of solvent to sample on extraction yield of total flavonoids

由图 2可见，当料液比由 1:8（g/mL）上升至1:12（g/mL）时，增加溶剂能够促进夏枯草中总黄酮的浸出。随后，夏枯草总黄酮的提取率有所下降。因此，选取 1:12（g/mL）的料液比为宜。

3.3 提取温度对总黄酮提取率的影响

根据 3.2 结果，选择料液比为 1:12（g/mL）、乙醇浓度为60%、超声波功率150 W、超声处理时间30 min，考察提取温度 50、55、60、65、70 ℃对总黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

由图3可见，在温度50℃～60℃之间随着温度的升高，总黄酮的提取率也逐渐增加，当高于60℃时，提取率不再增加反而出现降低趋势。这说明在较高温度下夏枯草总黄酮可能不稳定发生降解，从而影响总黄酮的提取率。因此提取最佳温度应该控制在60℃。

3.4 超声功率对总黄酮提取率的影响

根据3.3结果，选择提取温度60℃、料液比为1:12（g/mL）、乙醇浓度为 60%、超声处理时间 30 min，考察超声波功率 40、60、90、120、150 W 对总黄酮提取率的影响，结果见图4。

从图4可以看出，随着超声波功率的增大总黄酮的提取率随之增加，表明超声波功率增大有利于总黄酮的溶出，限于超声波最大功率为150 W，因此选择150 W为宜。

图4 超声功率对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasound power on extraction yield of total flavonoids

3.5 提取时间对总黄酮提取率的影响

根据3.4结果，选择超声功率150 W，料液比为1:12（g/mL）、乙醇浓度为 60%，提取温度 60 ℃、考察提取时间分别为 20、30、40、50、60 min 对总黄酮提取率的影响，结果见图5。

图5 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

从图5可知，总黄酮提取率随着提取时间的增加，总体趋势是上升。而在超声波处理时间大于40 min后提取率增加幅度很小，说明长时间的超声波作用对总黄酮的提取不会产生明显的作用，而且考虑到缩短工时减少能耗，因此提取时间以40 min为宜。

3.6 超声提取夏枯草黄酮工艺优化[10]

在单因素试验的基础上。选择乙醇浓度、温度和超声功率3个主要参数对超声提取夏枯草黄酮的工艺进行优化，采用Design-expert（V7.0）实验设计软件，根据Box-Behnken中心组合设计原理进行三因素三水平响应曲面法实验设计。其他参数料液比和超声提取时间分别固定为1:12（g/mL）和40 min。实验设计及结果见表1。

由实验结果可得到二次回归方程：

表1 三因素三水平Box-Behnken设计以及总黄酮提取率的实验值与预测值Table 1 Three levels Box-Behnken design with three independent variables,and the experimental and predicted yields of total flavonoids

Y=7.64-0.036A+0.048B+0.046C+0.0025AB+0.14AC-0.017BC-0.40A2-0.063B2+0.24C2

式中：A为乙醇浓度，%；B为提取温度，℃；C为超声功率，W；相关系数r2=0.9928。对表1实验数据进行参数优化后得到在乙醇浓度60%，提取温度61.4℃超声功率为150 W优化条件下，预测最高提取率为7.93%。通过验证实验得到提取率为7.92%，实验值与预测值非常接近，无显著差异。

4 结论

1）乙醇浓度、料液比、超声功率、超声提取时间、提取温度主要参数对夏枯草总黄酮的提取率都存在一定的影响。单因素实验结果表明，乙醇浓度为60%时提取率高；料液比为1:12（g/mL）比较合适；提取温度60℃；超声提取时间40 min；超声功率为150 W。

2）通过Box-Behnken实验得到超声提取夏枯草总黄酮的优化工艺条件：在乙醇浓度为60%、料液比为1:12（g/mL）、提取温度为 61.4℃、超声功率为 150 W、提取时间40 min。并在此条件下夏枯草总黄酮的提取率达到了7.92%。

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Technics of Ultrasound-assisted Extraction of Total Flavonoids in Prunella vulgaris L.

YANG Yuan-e1,TAN Wei2
（1.Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong,China；2.Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong,China）

Optimum extraction conditions of total flavonoids in Prunella vulgaris L.adopted ultrasound were studied.Effects of factors such as ethanol concentration，ration of solvent to sample,ultrasound power,extraction temperature and extraction time on extraction yield of total flavonoids in Prunella vulgaris L.had been investigated.On the basis of experimental results of single factor，experimental design of Box-Behnken was carried out and optimum extraction conditions were obtained.Extraction yield of total flavonoids in Prunella vulgaris L.reached 7.92%under the following conditions:ethanol of 60%condition,solvent to sample ratio 1:12（g/mL）,extraction temperature 61.4 ℃,ultrasound power 150 W and extraction time 40 min.

ultrasoud;Prunella vulgaris L.;flavonoid;extraction;response surface analysis

阳元娥（1974—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物提取与应用生物技术。

广东省自然科学基金资助项目（8451009001001374）

2010-09-11