低温提取南瓜多糖的理化性质及清除DPPH自由基作用

于斐，李全宏

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

低温提取南瓜多糖的理化性质及清除DPPH自由基作用

于斐，李全宏*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

首次采用低温水提的方法对南瓜多糖进行提取，从得率、理化性质、清除DPPH自由基活性方面对低温提取的南瓜多糖进行了研究，并与高温提取的南瓜多糖进行了比较。实验结果表明：经缓冻处理后，室温提取的南瓜多糖得率为5.06%，低于70℃提取的多糖得率5.48%（P>0.05）。低温提取的南瓜多糖为白色粉末，I2-KI反应阴性，分子量分布主要为4 ku～270 ku；低温南瓜多糖清除DPPH自由基的效果明显高于高温提取的南瓜多糖（P<0.05）。

南瓜；多糖；低温；性质；DPPH自由基

活性多糖是多糖中具有生物生理活性和特殊保健功能的一类物质。20世纪50年代，日本科学家首次发现香菇中存在能抗辐射和抑制肿瘤生长甚至使肿瘤缩小的物质，后证实这种物质是香菇多糖[1]。随后，国内外科学家掀起了一股研究开发活性多糖的热潮 ，目前国内外报道活性多糖的药理功能有：增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗辐射、抗病毒、降血糖、降血脂等[2]。目前南瓜多糖多采用热水浸提的方法获得，张拥军等采用60℃～100℃热水提取[3]，孔庆胜等采用了甲醇回流，煮沸6 h来提取[4]。根据研究报道，很多天然物质在高温时，易受到破坏，使其生物活性降低或丧失。但是多糖的结构和功能会不会受到高温的影响，低温提取的南瓜多糖（LTPP）与高温提取的南瓜多糖（HTPP）有什么差异，目前尚鲜见文献报道。因此，本课题就低温提取的南瓜多糖的性质进行了研究，并将其与高温提取的南瓜多糖的性质进行了比较。这一研究为活性多糖的研究提供了新的方向，也为今后的研究奠定了理论基础。

根据文献报道[5-6]，缓冻能明显提高南瓜多糖提取得率，尤其是缓冻的效果更为明显，为了准确、高效的提取分离到南瓜多糖的功能性成分，在实验中采用缓冻强化，低温提取的方法提取南瓜粗多糖。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜：购于市场；DPPH、葡聚糖标准品：sigma公司；透析袋MW3500：美国；其他试剂均为分析纯：购于国药集团。

TGL-16A台式高速冷冻离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；2802紫外可见分光光度计：尤尼科（上海仪器有限公司；液相：德国KNUAER公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 南瓜多糖的提取[7]

准确称取缓冻后的南瓜100 g，切块，打磨成浆，以料液比 1:4（g:mL）加入去离子水，浸提一定时间，4 层绢布过滤，收集滤液，45℃旋转蒸发至原体积的1/2。浓缩液即为南瓜多糖提取液。

1.2.2 脱蛋白

采用 Sevag 法进行。按多糖:氯仿:正丁醇=15:4:1的比例（体积比）振荡混，4000 r/min离心分离，反复进行多次，直至无白色沉淀为止。

1.2.3 醇沉

将无水乙醇缓慢加入到浓缩后的多糖溶液中，乙醇终浓度为75%，于4℃冰箱中醇沉12 h，4200 r/min离心20 min，收集沉淀，即得南瓜多糖。

1.2.4 透析

将样品溶液装入透析袋中，于去离子水中透析72h，以去除离子、小分子物质和多肽。

1.2.5 冷冻干燥

将透析液液进行冻干,最后得白色粉状南瓜多糖粗品。

1.3 测定方法

1.3.1 多糖含量测定[8-9]

采用硫酸-苯酚法进行测定。

1.3.2 蛋白质含量测定[8-9]

采用Folin-酚法进行测定。

1.3.3 还原糖含量测定[10]

DNS法。

1.3.4 平均聚合度测定[11]

平均聚合度=总糖含量/还原糖含量。

1.4 理化性质分析

1.4.1 Molish反应[12]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于试管中,加入2滴5%α-萘酚-乙醇溶液,揺匀,将试管倾斜,沿试管壁缓缓加入1 mL浓硫酸，竖直试管，观察浓硫酸和糖交界面颜色的变化。以纯水作阴性对照,淀粉溶液（1 mg/mL）作阳性对照。

1.4.2 硫酸-蒽酮反应[12]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于试管中，加入新配制的蒽酮试剂。摇匀，于沸水浴中加热10 min，取出冷至室温，观察颜色变化。对照同1.4.1。

1.4.3 碘-碘化钾反应[13]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于试管中，加入I2-KI溶液，观察颜色变化。对照同1.4.1。

1.4.4 分子量测定

色谱条件：Shodex SB-805 HQ，流动相0.1 mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱温 35 ℃。

标准曲线的制作：取适量葡聚糖标准品T5、T12、T25、T50、T270、T670溶于纯水。可得分子量与出峰时间的关系。

样品测定方法同上。

1.5 DPPH自由基清除作用的测定[14]

取一定浓度的糖溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL，混匀后，25℃静置20 min后在517 nm处测吸光度值。以蒸馏水代替样品作为空白，以酒精溶液代替DPPH-乙醇溶液作为对照。

DPPH 自由基清除率=[1-（Asample-Acontrol)/Ablank]×100%

2 结果与讨论

2.1 南瓜多糖得率

不同提取条件对南瓜多糖得率的影响见图1。

图1 不同提取条件下南瓜多糖的得率Fig.1 The yield of pumpkin polysaccharides at different conditions

由图1可知，缓冻后南瓜多糖的得率明显高于未缓冻的样品，这是由于缓冻过程中破坏了南瓜的细胞壁，更有利于多糖的溶出。高温也可以使南瓜细胞“崩解”促进多糖的溶出。缓冻和高温都可以起到破壁的作用，因此HTPP的得率虽然高于LTPP的得率，但是并没有显著的差别，而且随着时间的延长，高温提取的南瓜多糖的得率反而降低，可能是高温条件破坏了某些糖类的结构。因此，LTPP选择25℃，提取6 h；HTPP选择70℃提取4 h。

2.2 南瓜多糖的理化性质

南瓜多糖的理化性质见表1。

表1 南瓜多糖的理化性质Table 1 The Physicochemical properties of polysaccharide

南瓜多糖为白色粉末，溶于水，由表1可知，Molish反应呈阳性，硫酸-蒽酮反应呈阳性，说明提取物为多糖，I2-KI反应呈阴性，说明为非淀粉性多糖。Sevag法可以脱除游离蛋白，经脱蛋白后LTPP的蛋白含量明显高于HTPP，这可能是由于LTPP含有较多的南瓜糖蛋白复合物，从而使两者的功能性质产生差异。根据平均聚合度和分子量分布图，可知LTPP的分子量要低于HTPP，尤其是高分子量组分比较低。这也解释了LTPP溶解度较高的原因。

多糖标品的分布如图2所示，根据图2计算得多糖分子量分布的标准曲线：logM=-0.5501x+14794 R2=0.9878。根据样品的出峰时间，即可计算出样品的分子量分布范围，LTPP和HTPP的分子量见图3，计算可得，LTPP的分子量范围为：4 ku～270 ku；HTPP的分子量范围为：4 ku～270 ku。

图2 多糖标品的分子量分布图Fig.2 The molecular weight distribution of polysaccharide standard

2.3 清除DPPH自由基的作用

DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，与其他自由基评价抗氧化的方法相比，DPPH自由基方法能够快速的反应样品的抗氧化活性。南瓜多糖对DPPH自由基的清除作用见图4。

图3 南瓜多糖的分子量分布图Fig.3 The molecular weight distribution of pumpkin polysaccharide

图4 南瓜多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.4 The DPPH radical scavenging activity of punpkin polysaccharide

由图4可知，南瓜多糖对DPPH自由基有明显地清除作用，清除率和多糖的含量存在着一定的量效关系。这可能与南瓜多糖分子中的还原性的半缩醛羟基有关。南瓜多糖在2 mg/mL～5 mg/mL的范围能够有效的清除DPPH自由基，达到50%清除率需要LTPP的量为3.6 mg/mL。LTPP对DPPH自由基的清除作用要好于HTPP，尤其是在浓度增大时。其它抗氧化活性实验以及其抗氧化机制还需要进一步研究。

3 结论

本文对低温提取南瓜多糖的性质进行了研究，LTPP为白色粉末，主要为分子量分布范围为4 ku～270 ku的非淀粉多糖。缓冻处理可以有效提高南瓜多糖得率，而且低温提取可以节约大量能源，降低生产成本，实现环保生产。对南瓜多糖抗氧化的初步研究表明南瓜多糖具有良好的DPPH自由基清除作用，但对南瓜多糖的其他功能活性，尤其是高纯度的LTPP的药理作用，目前尚需进一步研究，为开发保健品和高附加值的工业化南瓜产品，提供理论依据。

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The Physicochemical Properties and Radical Scavenging Activity of Pumpkin Polysaccharides Extracted at Low Temperature

YU Fei,LI Quan-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

Crude water-soluble pumpkin polysaccharides were extracted from pumpkin pulp at room temperature（25 ℃）.The yield,physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides were studied and compared with which obtained at 70℃.The results indicated that after slow freezing treatment,the yield of polysaccharides extracted at 25℃ was 5.06%and that extracted at 70℃ was 5.48%.Their difference was not obviously.The pumpkin polysaccharides obtained at 25℃were white in colour,non-strach,and molecular weight ranged from 4 ku to 270 ku.Moreover the DPPH radical scavenging activity was higher than the polysaccharide obtained at 70℃.

pumpkin；polysaccharide；low temperature；propery；DPPH radical

自然基金（3067146）

于斐（1986—），女（汉），硕士研究生，研究方向：果蔬加工。

*通信作者：李全宏（1966—），男，博士生导师，教授，研究方向：农产品加工与综合利用。

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2010-08-31