木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白工艺条件的优化

张晓旭 ，赵国琦 ，*，钱利纯 ，曹崇海

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.浙江大学饲料科学研究所，浙江 杭州 310029）

木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白工艺条件的优化

张晓旭1，赵国琦1，*，钱利纯2，曹崇海2

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.浙江大学饲料科学研究所，浙江 杭州 310029）

对木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的工艺条件进行优化，探讨了酶量、温度、pH、酶解时间对木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的影响，运用二次回归正交旋转组合设计法，对四因素进行研究，确定了木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最优酶解参数。实验表明四因素对甲鱼蛋白水解度的影响大小依次为：酶用量＞pH＞时间＞温度，木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最佳酶解工艺条件为：酶用量14350.77 U/kg，反应温度69℃，pH 7.30，反应时间7 h。在此优化工艺条件下甲鱼蛋白的水解度可达19.53%。

木瓜蛋白酶；甲鱼蛋白；二次回归正交旋转组合设计；优化

甲鱼，又称鳖、团鱼，是一种珍贵的水生经济动物，自古以来就被视为食疗滋补的佳品，其肉质鲜嫩味美，且富含丰富的蛋白质、钙、磷、铁、硫胺素、核黄素及尼克酸等营养成分，具有很高的营养价值及药用价值[1-4]。近年来，随着人工养殖技术的快速发展，甲鱼市场出现了供大于求的现象，只有将甲鱼经过科学的加工处理，提取其有效成分，制成易消化吸收、即食性强的营养保健食品，才能提高甲鱼的利用率及消费量，并使甲鱼的保健作用得到充分发挥[5]。其中甲鱼的酶解技术是甲鱼食品生产的关键技术[6]。由于酸法水解和碱法水解条件比较剧烈，对甲鱼的营养成分破坏很大，同时水解产物的口感和风味不佳。而酶法酶解条件温和，效率高，酶解后营养成分损失少[7],徐怀德[8]报道甲鱼木瓜蛋白酶酶解产物的抗氧化性最好，因此在本试验中我们选用木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白。

本实验采用二次回归正交旋转组合设计对木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的工艺参数进行优化，确定木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最佳水解条件，为甲鱼深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲鱼由杭州中得实业有限公司提供；木瓜蛋白酶（360000 U/g）由广西南宁庞博生物工程有限公司提供。

DK-8D型电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；Centrifuge 5804R型高速冷冻离心机：eppendorf，德国生产；雷磁PHS-3C型pH计：上海精科雷磁仪器厂；AG 204型分析天平:METTLETOLEDO,瑞士生产；T6-新悦可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；J-6型多头磁力加热搅拌器：江苏金坛荣华仪器制造有限公司；JJ-2B组织匀浆机：金坛市精达仪器制造厂；微量凯氏定氮仪。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

甲鱼→宰杀→热烫去皮膜（95℃,10 s～15 s）→去内脏→去脂肪→高压蒸煮→去骨→匀浆（按质量体积比1:10）→制成匀浆液→测匀浆液中总氮含量→在不同酶解条件下酶解→灭酶（95℃,15 min）→4000 r/min，离心5 min→测酶解液中氨基态氮含量

1.2.2 酶活的测定

采用紫外可见分光光度计法测定[9]。

酶活力的定义：1 min内水解标准酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在275 mm处的吸光度与1 μg酪氨酸相当时所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.3 总氮含量的测定

采用凯氏定氮法（GB/T 6432-1994）测定。

1.2.4 氨基态氮含量的测定

采用甲醛滴定法[10]测定。

1.2.5 水解度的测定

水解度=氨基氮/总氮×100%

1.2.6 试验设计

1.2.6.1 单因素试验设计

分别研究酶量（6000、9000、12000、15000、18000 U/kg）、温度（50、55、60、65、70 ℃）、pH（6、6.5、7、7.5、8）、时间（5、6、7、8、9 h）对木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白参数的影响。

1.2.6.2 二次回归正交旋转组合设计

根据单因素试验的结果分析确定各因素水平范围，取单因子试验中效果较好的参数作为各因素的零水平进行四元五次回归正交旋转组合试验设计[11-13]，参试因子的水平设置及编码见表1。影响模型的建立是根据系统分析的观点采用四因子（1/2实施）二次正交旋转回归组合设计表2。每一参试因子的水平编码为-1.682，-1，0，1，1.682，整个实验设 23 个组合，依各组条件操作，测得各组氨基态氮含量，计算出相应的水解度。然后用SAS数据处理系统对试验数据进行分析，从而确定木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最佳酶解方案。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶量对酶解效果的影响

设定底物浓度为10%，酶解温度为45℃，pH为7，酶解时间为 6 h，分别添加 6000、9000、12000、15000、18000 U/kg的酶量，来研究木瓜蛋白酶的用量对酶解效果的影响，结果见图1。

图1 酶量对水解度的影响Fig.1 Effects of dosage of enzyme on DH

由图1可见，甲鱼蛋白的水解度随着酶用量的增加而增大。考虑到酶解的成本，木瓜蛋白酶的用量在9000 U/kg～15000 U/kg均可达到较理想的水解效果。

2.1.2 温度对酶解效果的影响

设定酶解时木瓜蛋白酶的用量为9000 U/kg，在底物浓度为10%，pH为7，酶解时间为6 h的条件下，分别设定酶解温度为 50、55、60、65、70 ℃来研究温度对酶解效果，结果见图2。

图2 温度对水解度的影响Fig.2 Effects of temperature on DH

由图2可以看出，当温度50℃～65℃范围时，随着温度的升高，水解度有所提高，当温度高于65℃时，水解度反而下降，这是由于温度过高导致酶或者蛋白质的变性，不利于水解的进行。木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的温度在60℃～70℃之间水解效果较为理想。

2.1.3 pH对酶解效果的影响

设定底物浓度为10%，酶量为9000 U/kg，酶解温度为 45℃，酶解时间为 6 h，pH 在 6、6.5、7、7.5、8之间变动，所得结果如图3所示。

由pH对酶解效果的影响图可以看出，在pH为7.5时木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的水解度达到最高，当酶解液pH>7.5时，水解度下降，这可能与碱性环境使木瓜蛋白酶变性失活有关。

图3 pH对水解度的影响Fig.3 Effects of pH on DH

2.1.4 时间对酶解效果的影响

设定底物浓度为10%，酶量为9000 U/kg，酶解温度为 45 ℃，pH 为 7,考察酶解 5、6、7、8、9 h 对酶解效果的影响，结果见图4。

图4 时间对水解度的影响Fig.4 Effects of time on DH

如图4所示，起初随着水解时间增加，水解度不断增大，当水解的时间达到8 h后，继续延长水解时间，水解度基本保持不变，这说明8 h时，酶与底物的结合已基本达到饱和，继续延长作用时间对酶解效果已没有影响，因此木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最佳反应时间为8 h。

2.1.5 小结

经过单因素试验，水解效果较好的参数为：酶量9000 U/kg～15000 U/kg,温度 60 ℃～70 ℃，pH 7.5,反应时间为8 h。

2.2 二次旋转正文试验结果与统计分析

根据单因素试验结果，选择优化因子的上下限范围，得到因素水平编码表（表1），试验结果见表2。

2.2.1 数学模型的建立

用Microsoft Execl对二次回归旋转组合试验统计方法对表2试验结果进行拟合，得到水解度的回归方程：

表1 因素水平编码表Table 1 Code table of factor level

表2 二次回归旋转组合设计及试验结果Table 2 Design and results of quadric regression orthogonal rotational experiment

2.2.2 模型显著性检验

为检验回归方程的有效性，对试验结果进行方差分析，按 F失拟=失拟均方/误差均方、F回归=回归均方/剩余均方进行显著性检验，结果见表3。由表3可知，F失拟＝4.5173＜F0.05（2，6），失拟项在 α=0.05 水平上不显著（P>0.05），表明模型拟合是合适的；F回归=5.6560＞F0.01（14，8），达极显著水平（P＜0.01），说明回归方程是极显著的。

甲鱼蛋白的水解度与酶用量、温度、pH以及作用时间的相关系数R2=回归平方和/总平方和=90.82%，表明该数学模型4个因素对产量的影响占90.82%，而其它因素的影响和误差仅占9.18%。

对回归系数显著性检验，在α=0.10显著水平剔除不显著项后，得到优化后的方程为：

表3 水解度试验结果方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

2.2.3 交互效应分析

通过对回归方程的分析可知，酶用量与温度、pH以及时间之间存在拮抗作用；而温度与pH以及时间之间存在协同作用。

2.2.4 蛋白质水解度主要因素效应分析

用“降维法”将任意3个因素固定在零水平，得到另一个因素与水解度的效应方程：

根据回归系数（绝对值）可知4个因素对甲鱼蛋白水解度（%）的影响顺序为：酶用量（X1）＞pH 值（X3）＞时间（X4）＞温度（X2）。

2.2.5 最佳酶解方案

用SAS数据处理系统对试验数据进行分析，求得甲鱼蛋白水解的最佳酶解方案为：酶用量在1.318水平（14350.77 U/kg），作用温度在 1.318水平（69℃），pH在-0.682水平（7.30），作用时间在-1.682水平（7 h）。此酶解方案得出的甲鱼蛋白的最佳水解度可达19.53%。

3 讨论

二次回归正交旋转组合设计是一种具有正交、回归、均匀和较高饱和程度的一种试验设计方法，属更高级的试验设计技术。它具有两个显著的优点：一、基本保留了回归正交设计试验次数少、计算简单以及部分地消除了回归系数间的相关性的优点；二、克服了在回归正交设计中二次回归预测值的方差依赖于试验点在因子空间中位置的缺点[14]。本试验通过二次回归正交旋转组合设计得到木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最佳酶解工艺参数，通过此酶解方案得出的甲鱼蛋白的最佳水解度可达19.53%，其结果显著高于殷金莲[15]等的报道。

本次试验中使用改进的氨基态氮的测定方法，借助精密pH计，能避免双指示剂甲醛滴定法测定时，由眼睛色差所引起的的误差。试验结果说明，甲鱼原料处理的差异、试验方法的不同以及甲鱼品种之间的差异，均会对试验结果产生影响。

另外在酶解蛋白质的过程中能够获得许多功能多肽，这些多肽对于我国生物医药和保健制品的开发，以及提高人类的健康水平具有重要意义[16-18]。Suetsuna-K[19]等利用酶水解沙丁鱼，从中得到抗氧化肽，徐怀德[20]对木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白酶解产物进行体外ACE抑制和抗氧化活性研究，证实甲鱼多台具有较强的体外ACE抑制活性和抗氧化活性。本试验只是对木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的参数进行了优化，两种或3种酶结合水解的效果是否会更好[21]，以及甲鱼酶解液的产品开发和产品的功能性等，目前还存在争议，有待进一步的研究。

4 结论

通过运用二次回归旋转组合试验统计方法对单因素试验结果进行拟合，建立了甲鱼蛋白的水解度对酶用量、酶解温度、pH及酶解时间4个试验因素的正交回归模型，得出了木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白的最佳酶解工艺条件。试验结果表明，在pH 7.30，温度69℃的条件下，用14350.77 U/kg的木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白7 h，甲鱼蛋白的水解度最高可达19.53%。

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The Optimal Parameters for Turtle Protein Enzymatic Hydrolysis by Papain

ZHANG Xiao-xu1,ZHAO Guo-qi1,*,QIAN Li-chun2,CAO Chong-hai2

（1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，Jiangsu,China；2.Feed Science Institute，Zhejiang University，Hangzhou 310029，Zhejiang,China）

Four single-factors（enzyme concentration,temperature,pH and time）for turtle protein enzymatic hydrolysis by papain were studied in this paper.By means of quadratic regression rotational combinational design,effect of four factors on the degree of hydrolysis of turtle protein were studied,a mathematical model of protein hydrolysis was established and an optimum parameters for turtle protein enzymatic hydrolysis.According to their influence on the yield of protein hydrolysis,the result showed that the ranking of the factors was enzyme concentration>pH>time>temperature.The optimum parameters for turtle protein enzymatic hydrolysis by papain was as following:the enzyme concentration 14350.77 U/kg,temperature 69℃,pH 7.30 and time 7 h.Under such condition,the degree of hydrolysis can come up to 19.53%.

papain;turtle protein;quadratic regression rotational combinational design;optimization

浙江省重大科技专项（2008C12023-2）

张晓旭（1983—），女（汉），硕士，研究方向：动物微生态营养与分子营养。

*通信作者：赵国琦，男，教授（博导），博士，研究方向：动物微生态营养与分子营养。

2010-08-01