类黄酮化合物的微生物代谢工程研究进展

左芳雷，马会勤，丁寅寅，赵建云，陈尚武，*

（1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院，教育部-北京市功能乳品重点实验室，北京 100083；2.中国农业大学 农学与生物技术学院，北京 100193）

类黄酮是一组广泛存在于植物中的多酚类物质，属于次级代谢产物，是存在于植物的叶、花、果中的天然色素，因多呈黄色而被称为类黄酮[1]。在植物中，类黄酮起到抑制酶活性，螯合金属离子，抵御紫外线、自由基、病原微生物危害等作用[2-3]。类黄酮还具有许多重要的生物学功能，如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗癌、调节血脂、雌激素样作用等（注：“雌激素样作用”学术上就是这种说法，英文为Estrogenic Effect）[4-5]。因此，类黄酮被广泛应用于医药、食品和保健品行业中。

然而，类黄酮在植物中的含量很低，其提取率不超过干重的1%，而且成本高，不易标准化[6-7]。随着现代生物技术的不断发展，采用基因工程手段构建工程菌，使利用微生物发酵代谢生产类黄酮成为可能，为寻找类黄酮新来源开拓了新的方法和思路，具有重要研究和生产价值。

1 类黄酮的结构和功能

类黄酮泛指由2个苯环(A与B环)通过中央三碳链相互结合的一系列C6-C3-C6化合物[1]，主要是指以2-苯基色原酮为母核的化合物。

天然的生物类黄酮多是其基本结构的衍生物，而且多以糖苷形式存在，因此植物界中存在各种各样的类黄酮物质，目前发现的已达6000余种[8]。黄酮类化合物根据其中央三碳链的氧化程度、B-环联接位置（2－或3－位）以及三碳链是否构成环状等特点，可分为8类[9]：黄酮（flavones）、黄酮醇（flavonols）、黄烷酮（flavanones）、异黄酮（isoflavones）、黄烷醇（flavanols）、黄烷酮醇（flavanonols）、查耳酮（chalcone）及花青素（anthocyanidins）。常见食品中黄酮类化合物种类与结构特点见表1[10]。

类黄酮具有突出的清除自由基、螯合金属离子和抗氧化能力，这是由其特殊结构决定的。一般认为,生物类黄酮分子的α、β不饱和吡喃酮是其具有各种生物活性的关键[11-12]。7-OH糖苷化和2、3位双键氢化均易引起类黄酮生物活性的降低，而A、B、C三环上的各种取代基则决定了其特定的生理功能。有效酚羟基理论[13]认为，B环上的3’和4’邻二羟基对清除自由基和机体组织中的脂质过氧化物起决定作用，而在抑制油脂自动氧化中，3-OH、5-OH、4-羰基和2、3 位的双键则起主导作用。因此，清除超氧阴离子自由基的能力：芦丁>槲皮素>桑色素>橙皮苷，而抑制油脂氧化的能力：槲皮素>桑色素>芦丁≈橙皮苷。在离体条件下,类黄酮通过清除超氧阴离子和羟自由基抑制起始阶段的脂类过氧化作用。类黄酮通过提供给过氧化基团氢原子产生类黄酮自由基终止自由基链式反应。类黄酮自由基反过来又和自由基团发生反应终止传递链。除了具有抗过氧化的性质,类黄酮上相邻的羟基或酮基能够螯合金属离子,而金属离子往往是氧化反应的催化剂和引发剂[14]。

表1 食品中常见黄酮类化合物和结构特点[10]Table 1 Common flavonoids and their structural features in food

2 植物中的类黄酮合成途径

植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。植物的次级代谢有多条途径，苯丙烷代谢途径从碳流的角度来看，是植物最重要的次生代谢途径之一，也是目前研究的较为透彻的次生代谢途径之一。在一个细胞中，有20%以上的代谢会通过这条途径，一切含苯丙烷骨架的物质都是由这一途径直接或间接生成的[15]。苯丙烷代谢途径产生木质素、芪类、黄酮和花青素类化合物等次生代谢物的共同代谢物中间体，这些中间体参与后续代谢途径就可以生成各种具有重要生物活性的植物次生代谢物。

类黄酮化合物是苯丙烷代谢途径产物经由类黄酮合成途径得到的一系列植物次生代谢物，类黄酮合成途径是苯丙氨酸代谢途径的重要分支。主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羟化酶（C4H）；4-香豆酸-辅酶A 连接酶(4CL)、查耳酮合成酶（CHS）、查耳酮异构酶（CHI）等几个关键酶[16]。在这些次生代谢酶类中，PAL是研究的较为详尽的酶，它使植物的次生代谢和初级代谢联系起来。莽草酸途径产生的苯丙氨酸经PAL解氨作用生成反式肉桂酸，从而进入苯丙烷代谢途径生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，PAL同时具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，可以利用酪氨酸代谢得到相同的产物。这些酸经C4H和4CL作用可进一步转化为相应的辅酶A酯。C4H是第一个被鉴定的植物细胞色素P450酶[17]，也是第一个既被克隆、又确定了功能的植物细胞色素P450酶，该酶行使功能需氧且依赖NADPH，它催化苯丙烷代谢途径的第一个氧化反应，在肉桂酸苯环结构的对位上催化位置特异性的羟化反应，将反式肉桂酸催化生成对-香豆酸；4CL催化各种羟基肉桂酸（香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等）生成相应的辅酶A酯类。这几步反应的产物及由这些产物经过其它代谢分支所产生的次级代谢产物统称为苯丙烷类物质。辅酶A酯类与3分子的乙酰辅酶A在CHS作用下生成查尔酮，由此进入类黄酮物质代谢途径。查尔酮是植物花青素类色素和植物类黄酮物质合成的前体[18]，在CHI催化下，或者在碱性条件下自发地生成相应的黄烷酮。黄烷酮再经过羟基化、烷化、氧化及糖苷化等反应就能得到许多具有重要生理功能的类黄酮物质。如由异黄酮合成酶（IFS）催化到得异黄酮；由花青素合成酶（ANS）催化得到花青素；由黄酮醇合成酶（FLS）催化得到黄酮醇等。

3 利用微生物合成类黄酮

类黄酮物质由于其重要的生理功能，尤其是清除自由基及抗癌防癌等作用，而在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。然而，类黄酮在植物中的含量很低，其提取成本高，得率低，品质差，环境影响大；利用化学方法人工合成类黄酮也有很多局限，如安全性低，并且合成的类黄酮是两种异构体的混合物，然而只有（2S）-类黄酮才具有生物活性[19]；通过植物细胞培养合成类黄酮也受到细胞存活期短、成本高、不易大规模培养等限制[20-21]；利用植物基因工程可以合成包括异黄酮在内的类黄酮物质，但是产量很低，主要是由于植物体中有众多的代谢支流，导致物质和能量向类黄酮合成方向的流动减弱[22]。

近年来，利用微生物发酵的方法合成类黄酮化合物迅速兴起。微生物生长快、易培养，基因工程技术的便捷有效等等都是无与伦比的优势。在微生物中构建类黄酮生物合成途径并进行发酵，有望实现类黄酮的大规模、工业化生产。现在构建类黄酮生物合成途径的主要宿主是大肠杆菌和酿酒酵母，而类黄酮合成相关基因的来源却各有不同。

3.1 大肠杆菌

Hwang等[23-24]于2003年在大肠杆菌（E.coli）中构建来自红酵母（Rhodotorula rubra）的PAL,来自天蓝色链霉菌A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2）的4CL 和来自甘草（Glycyrrhiza echinata）的CHS多酶基因体系，分别以3套质粒系统来表达代谢产生黄烷酮类物质：PAL-4CL-CHS连接一个T7启动子和一个核糖体结合位点(RBS)后与pET质粒相连；3个基因分别携带各自的RBS，共同使用一个T7启动子与pET质粒相连；3个基因携带各自的T7启动子和RBS与pET质粒相连。携带第1套质粒系统的工程菌株，可以以360 mg/L的酪氨酸和330 mg/L的苯丙氨酸为底物分别发酵得到0.570μg/L的柚皮素（Naringenin）和0.200μg/L的松属素(pinocembrin)，携带第2套质粒系统的工程菌株其产物的得率相比之下分别提高了85倍和43倍，而携带第3套质粒系统的工程菌株其产物的得率却得到了大幅度的提高，分别为794倍和3759倍，表明第3套系统代谢效率最高。这说明重组基因表达盒的组合方式对类黄酮物质的代谢生成有很大影响。另外，其构建的途径跳过了C4H基因，因为使用的4CL基因来自于天蓝色链霉菌A3（2），该酶既可以使用对-香豆酸（p-coumaric acid）为底物，也可以直接作用肉桂酸（Cinnamate）参与后续反应[25]。代谢生成的松属素和柚皮素为后续植物类黄酮物质合成的重要前体。

不久，Watts等[26]在E.coli中导入了从模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的PAL、C4H、4CL 和CHS基因，但因为难以表达得到有活性的C4H，所以反应在第1步过后就中止了。于是，他们加入外源的对-香豆酸，代谢得到柚皮素，加入外源3-（4-羟苯基）丙酸（3－（4－hydroxyphenyl）propionic acid），代谢得到根皮素（phloretin），加入外源阿魏酸（ferulic acid）和咖啡酸（caffeic acid）却没有代谢得到相应的黄烷酮。该小组又用从红假单胞菌（Rhodobacter sphaeroides）中克隆得到的酪氨酸解氨酶基因（TAL），替代了拟南芥PAL，并跳过了C4H，经过48 h的发酵，可以代谢产生20.8 mg/L的柚皮素。

然而，以上研究所得到的类黄酮产量很低，不能进行大规模的合成。有研究者通过增加宿主体内丙二酰辅酶A（Malonyl coenzyme A）的含量来提高类黄酮的合成。丙二酰辅酶A是大肠杆菌的限制性代谢物，也是合成黄酮类化合物的基础材料，由乙酰辅酶A羧化酶（ACC）催化乙酰辅酶A（Acetyl coenzyme A）生成。但是，超表达内源ACC却对大肠杆菌有害[27]。Miyahisa等[28]将来自酵母的PAL，来自天蓝色链霉菌A3（2）的ScCCL以及来自甘草的CHS，来自葛根（Pueraria）的CHI共同构建到pET载体上，另外，将来自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的乙酰辅酶A羧化酶基因（ACC）的两个亚基（accBG和dtsR1）连接在pRSFDuet-1质粒上，和上述pET表达载体共转化大肠杆菌，可以大大提高柚皮素的产量，达到60 mg/L。

Leonard等[29]通过4个非同源质粒将黄烷酮代谢途径的几个关键酶基因，即来自欧芹（Petroselinum crispum）的4CL，来自矮牵牛（Petunia x hybrida）的CHS和CHI，来自苹果属（Malus domestica）的黄烷酮3β-羟化酶基因（FHT），以及来自长春花（Catharanthus Roseus）的类黄酮3’,5’-羟化酶基因（F3’5’H）和P450还原酶基因（CPR），导入到大肠杆菌中，加入各种前体物质，几乎可以发酵产生除杨梅酮（myricetin）之外的所有黄酮类物质。研究者又将来自发光杆菌（Photorhabdus luminescens）的ACC的4个亚基构建到载体上，和以上4CL-CHS-CHI多基因体系在大肠杆菌中共表达，可以代谢合成196 mg/L的松属素和67 mg/L的柚皮素。由于ACC的羧化酶功能依赖于生物素连接酶（BPL，由birA基因编码）的作用，所以研究者又将birA与以上表达载体共表达，结果松属素产量增加到367 mg/L。然而，生物素昂贵，限制了类黄酮物质的大规模发酵。研究者又将乙酰辅酶A合成酶基因（ACS）导入大肠杆菌，与4CL-CHS-CHI和ACC共表达，代谢得到383 mg/L的松属素，外源添加少量的醋酸盐可以使松属素产量增加到429 mg/L[16]。

通过以上研究可见，设法提高宿主胞内丙二酰辅酶A的含量对类黄酮物质的大量合成有着重要意义。Leonard等继续对此进行研究，通过增加宿主碳代谢途径支路以及抑制非类黄酮合成途径来增加类黄酮物质合成的前体或辅因子，从而提高类黄酮的合成量。例如：将来自三叶草根瘤菌（Rhizobium trifolii）的基因matB和matC导入含有4CL-CHS-CHI重组基因的大肠杆菌宿主，可以将丙二酸盐转化为丙二酰辅酶A，添加外源丙二酸盐的工程菌可以代谢合成480 mg/L的松属素和155 mg/L柚皮素；为减少宿主本身丙二酰辅酶A的旁路流失，利用脂肪酸抑制剂浅蓝菌素（cerulenin）抑制脂肪酸合成酶FabB/F，代谢得到的松属素，柚皮素和圣草酚（eriodictyol）分别为710 mg/L，186 mg/L，和54 mg/L[30]。通过代谢工程手段调节大肠杆菌代谢网络，使碳代谢流向丙二酰辅酶A合成的方向，为类黄酮合成所用，可以极大地提高类黄酮的得率[31]。

其它类黄酮化合物也通过相同手段在大肠杆菌中合成。Yan等[32]将来自苹果属的FHT和花青素合成酶基因（ANS），来自红掌（Anthurium andraeanum）的二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）和矮牵牛（Petunia hybrida）的UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因（UFGT）构建到大肠杆菌中，向培养基中添加68 mg/L的柚皮素或 28.8 mg/L的圣草酚，可以得到0.440 mg/L的山奈酚（Kaempferol）和 0.444 mg/L 的槲皮素（quercetin），但是花青素（Anthocyanin）的合成量却很低。Miyahisa等[33]将来自欧芹的黄酮合成酶I基因（FNSI）导入含PAL-ScCCL-CHS-CHI重组基因的大肠杆菌中[28]，可由酪氨酸代谢生成13 mg/L的芹菜苷元（apigenin），由苯丙氨酸代谢生成9.4 mg/L的白杨素（chrysin）；将来自柑橘属（Citrus）的FHT和黄酮醇合成酶基因（FLS）导入相同的工程菌中时，可由酪氨酸代谢生成15.1 mg/L的山奈酚，由苯丙氨酸生成1.1 mg/L的高良姜素（galangin）。另外还有一些黄酮类化合物也能在大肠杆菌中合成，但是合成量很低[34]。

郝佳等[35]利用单质粒携带多个基因和多质粒共同导入的方法，构建了2套具有不同抗性的同源性pET质粒，将完全来自大豆（Glycine max）的PAL、4CL、CHS、CHI、IFS等基因重组到大肠杆菌中进行大豆异黄酮类物质的代谢工程研究，但未见进一步报道。

总的来看，通过基因工程和代谢工程手段，各类类黄酮化合物几乎都可以在大肠杆菌中合成，但是目的基因来源不同，其产物得率差异很大，其生物代谢产量目前尚不足以实现大规模工业化生产。另外，原核生物密码子使用偏好性与植物差异较大，也是影响基因表达效率和产率的重要限制因素。

3.2 酿酒酵母

酵母菌是真核微生物，作为宿主系统比大肠杆菌有更多的优势。首先，酵母菌是公认安全的微生物，可用于食品行业；更重要的是，它能够表达有生物活性的细胞色素P450酶。细胞色素P450酶是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶，类黄酮化合物合成的相关基因，包括C4H、IFS等，都属于P450酶。以酵母菌为宿主，可以使得植物源基因的翻译后修饰及酶学调控都和植物类似。因此，酵母菌是理想的合成类黄酮化合物的宿主菌。

Ro和Douglas[36]首次在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建苯丙烷类代谢途径起始多酶系基因PAL,C4H和CPR。分别由从白杨（Populus trichocarpa X Populus deltoides）来的两种苯丙氨酸解氨酶基因PAL2和PAL4构建了两个系统，PAL2-C4H-CPR和PAL4-C4H-CPR，研究了从苯丙氨酸到对-香豆酸过程中碳的代谢机制。另外，放射性标记实验证实，在酵母菌中C4H可以利用宿主内生的肉桂酸，而无需导入外源的PAL。

Jiang等[37]在酿酒酵母中构建来自红冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）的PAL，来自拟南芥的4CL和来自金丝桃（Hypericum androsaemum）的CHS多酶基因体系，由于该系统利用了来自真菌的PAL，它同时具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，从而跳过了C4H。每个基因在各自的GAL10启动子的控制下可以高效表达，由内源苯丙氨酸和酪氨酸可代谢产生7 mg/L的柚皮素，0.8 mg/L松属素，9 mg/L的根皮素，同时也检测到了很多其它中间代谢物的产生。

Yan等[38]在酿酒酵母中导入来自拟南芥的C4H，来自欧芹的4CL，来自矮牵牛的CHS和CHI多基因体系，代谢生成类黄酮物质并产生一系列中间代谢产物。此工程菌能以148.16 mg/L肉桂酸合成16.3 mg/L的松属素，以164.16 mg/L对-香豆酸合成28.3 mg/L的柚皮素，以180.16 mg/L咖啡酸合成6.5 mg/L的圣草酚。Leonard等[39]再将来自欧芹的FNSI或来自金鱼草（Antirrhinum majus）的FNSII，与来自酵母的CPR导入到含PALScCCL-CHS-CHI重组基因的酵母菌[29]。可以代谢合成芹菜苷元和木犀草素（luteolin），白杨素只有在fnsI表达时合成。

Katsuyama等[40]采取了酵母和大肠杆菌共同发酵的策略。大肠杆菌携带来自酵母的PAL，来自天蓝色链霉菌的ScCCL，来自甘草的CHS，来自葛根的CHI和来自谷氨酸棒状杆菌的ACC，酵母携带来自甘草的IFS，二者在添加了酪氨酸的培养基中共同发酵，可以由543 mg/L酪氨酸代谢产生6 mg/L的染料木素（genistein）。这说明，利用酵母和大肠杆菌双宿主系统发酵合成类黄酮物质是可行的，能够避免细胞色素P450酶难以在原核生物中有效表达这一障碍。

然而，即便是酵母染色体本身携带CPR基因，但是当外源P450酶超表达时，酵母内源CPR活性却是限制性因素[41]。共表达植物源的CPR基因相比却能提高产物的得率，说明酵母内源CPR基因不足以支持P450酶的高效表达[41-42]。Trantas等[42]将来自白杨的PAL、CPR 基因，来自大豆的C4H、4CL、CHS、CHI、IFS、F3H（黄烷酮3-羟化酶基因）、F3’H（类黄酮3’-羟化酶基因）以及来自马铃薯（Solanum tuberosum）的FLS构建到酿酒酵母中，重组菌可以代谢得到8.9 mg/L～15.6 mg/L的柚皮素，0.1 mg/L～7.7 mg/L的染料木素，0.9 mg/L～4.6 mg/L的山奈酚以及0.26 mg/L～0.38 mg/L的槲皮素。

Naesby等[43]将类黄酮合成的相关基因构建到酵母人工染色体（YAC）上，使得重组基因可以在宿主中稳定遗传，可以代谢得到柚皮素0.858 mg/L，山奈酚0.235 mg/L，同时也得到了其它类黄酮物质及中间产物。这是一个不同以往的在酵母菌中构建类黄酮代谢途径的方法，允许合成多种结构不同的类黄酮化合物，而且遗传稳定性好。

3.3 其它微生物

Parka等[44]将来自天蓝色链霉菌的ScCCL和来自拟南芥的CHS构建到表达载体pSE34（包含强启动子PermE）上，导入到委内瑞拉链霉菌（Streptomyces Venezuela）中。采取与H wang等[23]同样的方法，构建两类质粒系统。当ScCCL和CHS分别携带各自的RBS，共用一个PermE启动子时，可以代谢合成0.2 mg/L的柚皮素和0.4 mg/L的松属素；当ScCCL和CHS分别携带各自的RBS和启动子时，柚皮素和松属素的合成量分别提高6倍（1.2 mg/L）和5倍(2.0 mg/L)。这再次说明重组基因表达盒的组合方式对产物的合成有很大影响。又将来自拟南芥的CHS进行了密码子偏好性改造，结果柚皮素和松属素的合成量显著增加，达到4.0 mg/L和6.0 mg/L。这表明对外源基因进行密码子优化是提高产物合成量的有效途径。

4 总结与展望

以上研究证明，利用大肠杆菌和酿酒酵母为宿主，构建类黄酮合成途径，发酵生产类黄酮化合物是有效的，这表明利用基因工程以及代谢工程手段同样可以发酵生产其它种类的天然化合物。另外，也可以考虑利用其它微生物为宿主，如丝状真菌、乳酸菌、芽孢杆菌等。

在微生物中构建类黄酮合成途径，最重要的一个障碍仍然是C4H、IFS等细胞色素P450酶的有效表达问题。C4H、IFS酶行使功能要依附于内质网膜，需氧且依赖NADPH，而大肠杆菌缺乏内质网。一般的解决办法是利用来自天蓝色链霉菌的ScCCL替代植物4CL，同时跳过C4H。也有人利用TAL替代PAL，或者直接利用PAL的TAL活性发酵酪氨酸，也可以跳过C4H。另外，利用酿酒酵母和大肠杆菌共同发酵的方法，用酵母的内质网和P450还原酶来实现细胞色素P450酶的功能也是一个很好的选择。还有研究者将P450酶与P450还原酶融合起来，形成嵌合体，也可以实现P450酶在大肠杆菌中的有效表达[16，45]，而在酵母菌中，不必将P450酶与P450还原酶融合，只要共表达二者就可以提高P450酶的活力[46]。

对于不同来源的类黄酮合成相关基因，在宿主菌中的表达效率各有不同。针对宿主菌的密码子占用频率，对目标基因进行密码子优化能够提高基因在相应宿主中的表达效率。另外，目标基因的选择及其表达元件的组合方式，合适的启动子和相匹配的宿主菌选择对类黄酮合成效率的影响也很大。利用基因工程手段超表达所需要的基因，同时抑制代谢支路的基因可以使能量及物质向合成类黄酮的方向流动，从而提高类黄酮的合成产率。

在工程菌发酵过程中，利用发酵工程技术优化培养条件，如工程菌培养密度以及不同的碳源、氮源等营养条件，可以使得工程菌最大限度地合成类黄酮。

总的来看，关于类黄酮化合物的微生物代谢工程的研究已经有了很多基础，可以实现工程菌发酵生产类黄酮。然而，利用微生物发酵实现类黄酮的大规模、工业化生产还需要更进一步的研究。

[1]Robards K,Antolovich M.Analytical chemistry of fruit bioflavonoids-A review[J].Analys,1997,112:11R-34R

[2]Harborne JB.The flavonoids:advances in research since 1986[M].London,New York,Chapman and Hall,1st edition,1994：676

[3]Nelson DJ.Flavonoid aglycones from eriodictyon californicum resin and their implications for herbivory and UV screening.[J].Biochem Syst Ecol,1983,11(3):211-215

[4]Harborne JB，Williams CA.Advances in flavonoid research since 1992.[J].Phytochemistry,2000,55(6):481-504

[5]唐传核，彭志英.类黄酮的最新研究进展-生理功能[J].中国食品添加剂，2002(1):5-10

[6]Morita H,Noguchi H,Schroder J,et al.Novel polyketides synthesized with a higher plant stilbene synthase[J].Eur J Biochem,2001,268(13):3759-3766

[7]Wang KJ,Yang CR,Zhang YJ.Phenolic antioxidants from Chinese toon(fresh young leaves and shoots of Toona sinensis)[J].Food Chem,2007,101(1):365-371

[8]Erlund I.Review of the flavonoids quercetin,hesperetin and naringenin.Dietary sources,bioactivities,bioavailability,and epidemiology[J].Nutr Res,2004,24(10):851-874

[9]陈春刚,韩芬霞.生物类黄酮的研究与应用综述[J].安徽农业科学,2006,34(13):2949-2951

[10]BeecherGR.Overview of dietary flavonoids:nomenclature,occurrence and intake[J].J Nutr,2003,133:3248-3254

[11]Cao G,Sofic E,Prior RL.Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids:structure-activity relationships Free Radical[J].Biol Med,1997,22(5):749-760

[12]Heim KE,Tagliaferro AR,Bobilya DJ.Flavonoid antioxidants:chemistry,metabolism and structure activity relationships[J].J Nutr Biochem,2002,13(10):572-584

[13]胡春,丁霄霖.黄酮类化合物在不同氧化体系中的抗氧化作用研究[J].食品与发酵工业，1996(3):46-53

[14]王龙,孙建设.类黄酮的化学结构及其生物学功能[J].河北农业大学学报,2003,26:144-147

[15]欧阳光察,薛应龙.植物苯丙烷代谢的生理意义及调控[J].植物生理学通讯,1988,24(3):9-16

[16]Leonard E,Yan Y,Koffas MA.Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant -specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli[J].Metab Eng,2006,8(2):172-181

[17]Russell DW.The metabolism of aromatic compounds in higher plants[J].J Bio Chem,1971,246(12):3370-3878

[18]何水林,郑金贵,林明,等.植物芪类次生代谢物的功能、合成调控及基因工程研究进展[J].农业生物技术学报,2004,12(1):102-108

[19]Andersen O M,Markham K R，et al.Flavonoids：chemistry，biochemistry,and applications[C].CRC,Boca Raton.2006：pp1197

[20]Bourgaud F,Gravot A,Milesi S,et al.Production of plant secondary metabolites:a historical perspective[J].Plant Sci,2001,161(5):839-51

[21]Pietta P G.Flavonoids as antioxidants[J].J Nat Prod,2000,63(7):1035-1042

[22]Hou D X,Fujii M,Terahara N,et al.Molecular mechanisms behind the chemopreventive effects of anthocyanidins[J]. J Biomed Biotechnol,2004(5):321-325

[23]Hwang E I,Kaneko M,Ohnishi Y,et al.Production of Plant-Specific flavanones by Escherichia coli containing an artificial gene cluster.[J].Appl Microbiol Biotechnol,2003,69(5):2699-2706

[24]Kaneko M,Hwang E I,Ohnishi Y,et al.Heterologous production of flavanones in Escherichia coli: potential for combinatorial biosynthesis of flavonoids in bacteria[J].J Ind Microbiol Biol,2003,30(8):456-461

[25]Kaneko M,Ohnishi Y,Horinouchi S.Cinnamate:coenzyme A ligase from the filamentous bacterium Streptomycescoelicolor A3(2)[J].J Bacteriol,2003,185(1):20-27

[26]Watts K T,Lee P C,Schmidt-Dannert C.Exploring recombinant flavonoid biosynthesis in metabolically engineered Escherichia coli.[J].Chem Bio Chem,2004,5(4):500-507

[27]Davis M S,Solbiati J,Cronan J E Jr.Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli[J].J Biol Chem,2000,275:28593-28598

[28]Miyahisa I,Kaneko M,Funa N,et al.Efficient production of（2S）－flavanones by Escherichia coli containing an artificial biosynthetic gene cluster.Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(4):498-504

[29]Leonard E,Lim K H,Saw P N,et al.Engineering central metabolic pathways for high-level flavonoid production in Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(12):3877-3886

[30]Leonard E,Yan Y,Fowler Z L,et al.Strain improvement of recombinant Escherichia coli for efficient production of plant flavonoids[J].Mol Pharm,2008,5(2):257-265

[31]Fowler Z L,Gikandi W W,Koffas M A.Increased malonyl coenzyme a biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009,75(18):5831-5839

[32]Yan Y,Chemler J,Huang L,et al.Metabolic engineering of anthocyanin biosynthesis in Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(7):3617-3623

[33]Miyahisa I,Funa N.Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,71(1):53-58

[34]Leonard E,Chemler J,Lim K H,et al.Expression of a soluble flavone synthase allows the biosynthesis of phytoestrogen derivatives in Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,70（1）:85-91

[35]郝佳,马会勤,代茹,等.大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达[J].生物工程学报,2007，23(6):1022-1028

[36]Ro D K,Douglas C J.Reconstitution of the entry point of plant phenylpropanoid metabolism in Yeast(Saccharomyces cerevisiae):implications for control of metabolic flux into the phenylpropanoid pathway[J].J Bio Chem,2004,279:2600-2607

[37]Jiang H X,Wood K V,Morgan J A.Metabolic engineering of the phenylpropanoid pathway in Saccharomyces cerevisiae[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(6):2962-2969

[38]Yan Y J,Kohli A,Mattheos A G.Biosynthesis of natural flavanones in Saccharomyces cerevisiae[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,71(9):5610-5613

[39]Leonard E,Yan Y,Lim K H,et al.Investigation of two distinct flavone synthases for plant-specific flavone biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(12):8241-8248

[40]Katsuyama Y,Miyahisa I,Funa N.One-pot synthesis of genistein from tyrosine by coincubation of genetically engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae cells[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,73(5):1143-1149

[41]Urban P,Werck-Reichhart D,Teutsch H G,et al.Characterization of recombinant plant cinnamate 4-hydroxylase produced in yeast：kinetic and spectral properties of the major plant P450 of the phenylpropanoid pathway[J].Eur J Biochem,1994,222(3):843-850

[42]Trantas E，Panopoulos N,Ververidis F.Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae[J].Metab Eng,2009,11:355-366

[43]Naesby M,Nielsen S V,Nielsen C A,et al.Yeast artificial chromosomes employed for random assembly of biosynthetic pathways and production of diverse compounds in Saccharomyces cerevisiae[J].Microb Cell Fact,2009,8(45)：45-46

[44]ParkaSR,YoonaJA.Engineering of plant-specific phenylpropanoids biosynthesis in Streptomyces venezuelae[J].J Biotechnol,2009,141(3/4):181-188

[45]Hotze M，Schroder G，Schroder J.Cinnamate 4-hydroxylase from Catharanthus roseus,and a strategy for the functional expression of plant cytochrome P450 proteins as translational fusions with P450 reductase in Escherichia coli[J].FEBS Lett,1995,374（3):345-350

[46]Kim D H，Kim B G，Lee H J.Enhancement of is of lavone synthase activity by co-expression of P450 reductase from rice[J].Biotechnol Lett，2005,27(17):1291-1294