宜宾浓香型白酒窖泥中细菌的系统发育多样性*

王涛，田时平，赵东，游玲，王松，冯瑞章，冯学愚，张云，崔晓龙

1(宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾，644000)2(发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾，644000)3(云南大学省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五粮液股份公司，四川宜宾，644000)

宜宾浓香型白酒窖泥中细菌的系统发育多样性*

王涛1，2，田时平3，赵东4，游玲2，王松1，2，冯瑞章1，2，冯学愚2，张云1，崔晓龙3

1(宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾，644000)2(发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾，644000)3(云南大学省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五粮液股份公司，四川宜宾，644000)

采用纯培养和免培养(culture-independent)分析方法，对宜宾多家规模以上白酒企业成熟窖泥细菌多样性进行了研究。采用改良牛肉膏蛋白胨培养基(NA)和高氏I号分离培养基分离细菌(包括放线菌)，并评价菌株的乙醇耐受能力和低pH耐受能力。构建了窖泥样品总DNA的16S rRNA基因克隆文库。分别挑选不同培养特征的89株细菌纯培养物和427个基因克隆的16S rRNA基因序列，进行系统发育分析。89株纯培养物分属于13个属，以Streptomyces(39株)和Bacillus(27株)为优势属。纯培养菌株中，具备7%浓度乙醇耐受能力和低pH(4.5)耐受能力的分别有16株和10株。挑取的克隆子经测序、去除嵌合体后，得到了406个有效序列，并在97%的序列相似性水平上可将其分为75个 OTU(Operational Taxonomic Unit)，分属于 Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8 个纲。其中 Clostridia 为绝对优势菌群，包含50个OTU、227个克隆子;Bacilli包含11个OTU、128个克隆子，为次优势菌群。证明宜宾浓香型白酒窖泥中细菌群落存在丰富的系统发育多样性。

浓香型白酒，窖泥，细菌，16S rRNA基因，系统发育多样性

以固态泥池(窖池)发酵为典型特征的浓香型白酒是我国特有的传统发酵产品，其产量和收入均占到了我国白酒产业的70%以上。长期的生产实践表明，窖池泥土(窖泥)中复杂的微生物群落与浓香型白酒中复杂的呈香呈味物质形成直接相关，与产品质量和酒体风格有着十分密切的关系［1］。在浓香型白酒生产中，糟醅在窖池内发酵周期长达60 d以上。通常情况下，发酵2～3周后，窖池内就处于厌氧状态，乙醇浓度达到5% ～6%及以上，pH值缓慢下降到3～4［2］。在长期不间断的生产中，窖泥一直处于相对稳定和特殊的生态环境中，其中的微生群落在持续且相对稳定选择压下可能逐渐趋于稳定且具备一定的特殊性。

目前对浓香型白酒窖泥微生物的研究主要涉及微生物群落组成及其变化规律、功能微生物的分离及应用等［3－5］。尽管通过这些研究初步认识了窖泥微生物群落，获得了一些有用的菌株并已应用于实际生产，但这些研究均存在采集的样品较少(仅采集了一个酒厂的窖泥)、研究手段单一(仅采用了纯培养研究方法)、研究不够深入(许多研究仅对窖泥微生物开展了表观形态和菌落计数研究)等问题。宜宾为中国优质浓香型白酒的主要产区，对宜宾窖泥微生物群落开展系统的研究，既有利于指导行业稳定及提高产品质量，提高出酒率，还有利于进一步正确认识浓香型白酒发酵机理。

1 材料与方法

1.1 材料

采集了宜宾6家规模以上浓香型白酒生产企业多口窖的窖泥，采样时间为2008年3～4月。取样窖池使用年限均在20年以上，每口窖取窖壁上、中、下层各4点(4面窖壁)及窖底中央窖泥各100g，每个企业窖泥样品单独混合。

1.2 分离

采用改良牛肉膏蛋白胨培养基(NA)分离细菌、改良的高氏I号培养基分离放线菌。定期观察分离平板，挑取单菌落划线纯化于常规NA或高氏I号斜面上。根据菌落的颜色、大小、突起特征、边缘特征、表面光滑与否和透明度等肉眼可辩的特征去除冗余。

1.3 菌株16S rRNA基因分析

1.3.1 DNA提取、扩增及测序

根据文献［6］适当修改，提取菌株基因组DNA、扩增出16S rRNA基因片段。引物27f:5'－AGAGTTT-GATCTGGCTCAG－3'和1541 r:5'－AAGGAGGTGATC CAGCCGCA － 3'［7］。扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司(Sangon)纯化并测序，测序长度700－900 bp，序列已在GenBank注册。

1.3.2 系统发育分析

所得序列用EzTaxon server 2.0［8］在线进行相似性分析，对克隆的16S rRNA基因序列还采用Blast进行相似性分析。用ClustalX按照最大同源性的原则进行比对，并用BioEdit 5.0.9进行检验;采用Mega 4.0进行系统进化树(neighbour－joining tree)的构建、编辑与保存，序列相似值选用Kimura－2［9］计算，自举值(bootstrap value)分析设置1000个数据样本［10］。对聚在一条直线的菌株，通过ClustalX比对确定其序列相似度为100%后，合并成一个类群。

1.4 菌株对乙醇和低pH值耐受能力

参照文献［11］的方法适当修改，检测菌株在7%的乙醇(V/V)和pH 4.5环境下的耐受能力。

1.5 克隆文库构建及系统发育分析

1.5.1 窖泥总DNA提取和16S rRNA基因片段的PCR扩增

采用文献［12］方法适当改进，采用试剂盒(GENECLEAN Turbo Kits)进行DNA纯化。采用与纯培养菌株一样的引物，将在各个退火温度下(52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃)扩增的产物混合后用多功能纯化回收试剂盒(百泰克)纯化。

1.5.2 PCR产物克隆

用氯化钙法制备感受态大肠杆菌，利用pMD○R19-T Vector试剂盒(宝生物)，得到PCR产物克隆。

1.5.3 重组子筛选及测序

用引物M13f和M13r进行插入的16S rDNA片段检测后，阳性克隆子送往上海生物工程有限公司(Sangon)测序。运用Mallard［13］软件进行嵌合体检验并去除嵌合体后，使用DOTUR1.53［14］软件把序列相似性大于97%的序列划分为同一个OTU(Operational Taxonomic Unit)［15］，并利用 Analytic Rarefaction Win v.1.3软件(S.Holland，Stratigraphy Lab，University of Georgia，Athens;www.uga.edu/～ strata/software/)绘制稀有性曲线，根据文库的Coverage C值确定是否补充克隆子测序。

1.5.4 序列相似性检索

每个OTU随机选择1个代表序列分别通过EzT-axon server 2.0［8］和 Blast软件在线与典型菌株16S rRNA基因和GenBank数据库中已知有效序列进行比对进行相似性分析。与“1.3.2”部分相同的方法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 窖泥可培养细菌的多样性

经过菌落和细胞形态表观去除冗余后，得到89株纯培养菌株。对其进行16S rRNA基因测序后，经序列比对、相似性分析和系统发育分析(表1，图1)，发现89株菌与13个属的38个种的典型菌株(未列出)序列相似性大于97%。89株菌中，属于Streptomyces的菌株最多(39株)，其次为Bacillus(27株)，它们占到了菌株总数的74.2%。其余各属菌株均在4株及以下，有4个属仅分离到1株菌。

表1 纯培养菌株的16S rRNA基因相似性分析及乙醇、pH 4.5耐受性检测结果

89株细菌中，能够在含有体积分数为7%乙醇培养基中生长的菌株有16株(Bacillus 15株、Brevibacterium 1株);能够耐受pH值为4.5的培养基的细菌有10株(Streptomyces 7株、Bacillus 3株)。其中，只有 1株与 Bacillus cereus典型菌株(ATCC 14579)16S rRNA基因相似度达99.5%的兼性厌氧菌既能耐受7%浓度的乙醇，又能耐受pH 4.5。

图1 89株细菌与相关典型菌株构建的基于16S rRNA基因序列的系统发育树

2.2 免培养法分析细菌的多样性

共测定了427个克隆，经检测去除21个嵌合体序列后，406条有效序列在97%的相似度上划分为75个OTU，文库的Coverage C达到93.3%(文库的稀有性曲线如图2)，表明这些克隆代表了文库中绝大多数细菌微生物的多样性。EzTaxon server 2.0和Blast软件相似性比对的结果如表2、表3(为显示清晰，结合系统发育信息对OTU进行了重新归类)，构建的系统发育树如图3。

相似性比对和系统发育分析，75个OTU分属于Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8个纲。其中Clostridia为绝对优势菌群，包含50个OTU、227个克隆子(表2)，分别占OTU总数和克隆子总数的66.7%和55.9%。Bacilli包含11个OTU、128个克隆子，分别占14.7%和31.5%。其余的6个纲分别占OTU和克隆子总数的12.0%(9个OTU)和12.56%(51个克隆)(具体情况见表3)。所以从纲(Class)一级分类单位来看，Clostridia和Bacilli为优势菌群，且优势明显。

图2 窖泥细菌16S rRNA基因克隆文库的稀缺性曲线

表2 1 50个属于Clostridia的OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析结果

续表2

表3 属于Clostridia以外7个纲的25个OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析结果

有26个OTU(231个克隆，占克隆总数的56.90%)的代表序列与对应的典型菌株16S rRNA基因的相似度在97%以上，其中包含克隆数量处于前2位且显著多于其他OTU的YJN51(相似度99.6%，73个克隆)和YJN31(相似度97.4%，52个克隆)，这26个OTU中克隆所代表的微生物可初步判定为对应属的微生物［16－17］。其中属于 Lactobacillus属的克隆数最多(95)，其次为Clostridium(65)，其后依次是Serratia(21)、Bacillus(21)、Streptomyces(6)、Staphylococcus(4)、Weissella(4);Oceanobacillus、Alkalibaculum、Petrimonas、sulfuriphila、Propionibacterium、Rubellimicrobium和Acinetobacte各有2个克隆，Thermus、Rhizobium和Brevundimonas各有1个克隆。其他的克隆可能均可能代表新分类单位，而且有75个克隆(分属于20个OTU)与最接近的典型菌株16S rRNA基因的相似性在90%以下(最低的仅82.1%)，且与数据库中最接近的序列均为Uncultured bacterium clone的序列。所以，从能够初步确定的17个属一级分类单位来看，Lactobacillus和Clostridium占据了绝对优势，同时还有176个克隆所代表的微生物代表着属及以上分类单位的新类群。

图3 窖泥中克隆序列与已知细菌相关序列构建的16S基因序列系统发育树

3 讨论

本研究中，2种方法的研究结果都显示宜宾浓香型窖泥中存在着丰富的细菌多样性。纯培养显示的13个属中，有5个属(Rubellimicrobium、Staphylococcus、Streptomyces、Bacillus、Serratia)在免培养研究中被检测到，而且尽管分属于这5个属的菌株高达76株(占分离菌株的84.40%)，但还有8个属没有在免培养分析结果中体现。而免培养所显示的17个属和大量的潜在新分类单位中，只有上述的5个属(共54个克隆，占检测克隆总数的13.35%)在纯培养分析中被检测到。其余的12个属(含2个绝对优势属)和所有的潜在新分类单位(占检测克隆总数的86.65%)没有在纯培养研究结果中体现。这些和纯培养技术仅能获得环境中极少一部分微生物［18］和免培养方法也存在一定的局限性［19］是吻合的。

纯培养和免培养分析结果均显示浓香型白酒窖池中存在抗逆性较强的芽孢(孢子)细菌，数量占绝了对优势。Clostridia和Bacilli 2纲中所有已知的菌株均可产生芽孢，而这2个纲的细菌共占了OTU总数的88.00%和克隆总数的87.44%;纯培养菌株中，Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus、Rummeliibacillus 4个属(共37株菌)可以产生芽孢，数量最多的为可产生孢子的Streptomyces属菌株(39株菌)。同时，纯培养菌株中能够在7%乙醇的培养基和pH 4.5的培养基中生长的菌株分别有16株和10株。这表明，在长期不间断生产所形成较高乙醇浓度、较低pH条件环境选择下，窖泥中形成了主要种群能够顺利延续，从而保持群落相对稳定的细菌群落。

浓香型白酒的主体呈香呈味物质为乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯(其中尤以己酸乙酯最为重要)，它们主要在厌氧条件下由有机酸在酯酶的催化下与乙醇生成［1］。属一级分类单位中，优势属Lactobacillus和Clostridium分别为兼性厌氧细菌和专性厌氧细菌，表明这2个属的菌株有在后期厌氧条件下生长繁殖的可能。Lactobacillus属的菌株除了产生乳酸外，在一定条件下也会产生乙酸、丁酸、己酸等［20］及催化酯化反应的酯酶［21］。而 Clostridium 属的菌株几乎都可以产生小分子有机酸。1945年就已经报道1株Clostridium kluyveri能够在厌氧条件下产生己酸、丁酸和乙酸［22］，随后大量Clostridium属的菌株被报道能够产生包含己酸在内的上述4种有机酸［23－25］。而本研究中与 Clostridium kluyveri典型菌株序列相似性在97.4%的OTU包含了52个克隆，在所有OTU处于第2位。这些都显示窖泥中的主要细菌类群可能与浓香型白酒的生产存在着密切的关系。

浓香型白酒窖泥中存在丰富的系统发育多样性，这个群落中的主要类群具备在窖泥特殊的生态环境下生长繁殖，从而保证其群落稳定性的能力。由于浓香型白酒不同窖池之间、同一口窖池不同部位之间的微生物群存在较大差异，而且其中的微生物群落还会随着不同季节和发酵的不同阶段产生波动，所以要全面揭示浓香型白酒窖泥中细菌群落的多样性及其与浓香型白酒的生产的关系，需要更为全面的采集样品、采用多种方法从不同侧面开展系统的研究。

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Bacterial Diversity of Mud Samples from Fermentation Pits of Multi-grain Strong-flavor Liquor Factories in Yibin，Sichuan Province，China

Wang Tao1，2，Tian Shi-ping3，Zhao Dong4，You Lin2，Wang Song1，2，Feng Rui-zhang1，2，Feng Xue-yu2，Zhang Yun2，Cui Xiao-long3
1(College of Life Science＆ Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China)2(Key Laboratory ofFermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin University，Yibin 644000，China)3(Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming 650091，China)4(Wuliangye Group Co.，Ltd.，Yibin 644000，China)

The aim of this study was to investigate bacterial diversity of mud samples from fermentation pits of multi-grain strong-flavor liquor factories in Yibin Sichuan province.We employed modified nutrient agar medium and Gogan-I medium for isolation and cultivation，and constructed 16S rRNA gene clone library with universal bacteriaspecific primers.Then the 16S rRNA gene sequences of the isolates and clones were analyzed，and the isolates were tested for capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Eighty-nine strains with different culture characteristics and 427 clones from sample were selected for 16S rRNA gene sequences analysis.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that the 89 strains belonged to 13 genera，and Streptomyces，Bacillus are dominant genera with 39 strains and 27 strains，respectively.Four hundred and six sequences of clones(21 chimeras wiped off)were defined into 75 operational taxonomic units(OTUs)according to the 97%similarity threshold for OTU assignment by the software program DOTUR.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that these OTUs belonged to Clostridia，Bacilli，Actinobacteria，γ-Proteobacteria，α-Proteobacteria，Deinococci，Planctomycea，Bacteroidia.Clostridia and Bacilli are dominant classes with 50 OTUs(227 clones)and 11 OTUs(128 clones)，respectively.Sixteen and 10 strains of 89 strains showed the capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Bacteria of fermentation pits mud present plentiful diversity.

Multi－grain strong－flavor liquor，Pit mud，bacteria，16S rRNA gene，phylogenetic diversity

硕士研究生。

*四川省科技厅支撑计划项目(2008NZ0031，2010NZ0029，2010NZ0091);四川省科技厅应用基础项目(2009JY0149);四川省教育厅重大培育项目(09ZZ039);四川省属高校白酒生产技术创新团队建设计划资助;宜宾市科技专项研究项目(200805303、2010ZGY016)

2011－06－09，改回日期:2011－07－13