不同添加剂对小麦PPO的抑制和激活效应

司红起 冯继明 卢 杰 马传喜

不同添加剂对小麦PPO的抑制和激活效应

司红起 冯继明 卢 杰 马传喜

(农业部安徽省小麦区域技术创新中心安徽小麦产业工程技术研究中心省部共建分子植物育种重点实验室安徽农业大学农学院，合肥 230036)

通过测定76个小麦品种全麦粉中多酚氧化酶(PPO)在6种化学试剂作用下的酶活性变化情况，比较了这6种化学试剂对PPO的抑制和激活效应，同时分析了添加剂浓度和基因型对抑制激活效应的影响。结果表明:小麦PPO的抑制和激活效应同时受添加剂种类、添加剂浓度和基因型影响;亚硫酸氢钠、铜试剂、谷胱甘肽和维生素C对小麦PPO产生抑制效应，蔗糖和低浓度柠檬酸产生激活效应，而高浓度柠檬酸产生抑制效应，亚硫酸氢钠的抑制效应比维生素C和谷胱甘肽强;维生素C、谷胱甘肽、铜试剂和亚硫酸氢钠的添加浓度与PPO活性呈对数关系;谷胱甘肽和维生素C可考虑作为抑制小麦PPO活性的食品添加剂。

小麦 多酚氧化酶 添加剂 抑制剂 褐变 色泽

多酚氧化酶(PolyPhenol Oxidase，PPO)又叫酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶、氯原酸酶等，因其能结合Cu2+，故又称金属蛋白。其主要参与酶促褐变反应而生成有色物质，造成植物经济价值降低，同时还可能与植物的应激免疫反应有关，如感染病虫害、早熟、早衰和机械损伤都能诱导多酚氧化酶活性的上升。多酚氧化酶广泛存在于植物界中。目前对小麦PPO的研究主要集中在 PPO活性检测［1－3］、PPO与鲜面片和小麦粉色泽的关系［4－7］、PPO 分子标记及其基因克隆定位［8－11］等方面，在小麦 PPO活性控制方面研究相对较少［12－15］。由于PPO活性高是导致小麦粉和面团褐变的主要原因［4－7］，所以对小麦PPO活性进行控制已成为当前研究热点之一［12－15］。司红起等［16－17］研究了氯化铜、铜试剂、巯基乙醇、EDTA、饱和NaCl和SDS对小麦PPO活性的影响，指出铜试剂、巯基乙醇和EDTA能较好地抑制小麦PPO活性。本研究以遗传多样性极其丰富的微核心种质为试材又分析了柠檬酸、维生素C、蔗糖、亚硫酸氢钠、谷胱甘肽和铜试剂对小麦PPO的抑制和激活效应，旨在寻求一个能有效控制小麦PPO活性、防止小麦粉和面团褐变、提高小麦粉和食品加工品质的有效方法，进而为今后小麦粉及食品加工、小麦品质育种及寻求无毒害食品添加剂提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1．1 材料和设备

选取76份小麦微核心种质作为供试材料，2006年收获于安徽农业大学农场内。

UV755B分光光度计:上海精科实业有限公司;3K30冷冻离心机:德国Sigma公司;Cyclotec 1093样品磨:丹麦FOSS公司。

1．2 试验方法

1．2．1 全麦粉的制备

采用带0．5 mm筛的1093样品磨对上述76个小麦品种进行磨粉处理。

1．2．2 小麦PPO活性检测

参考AACC 22－85进行测定。称取0．300 0 g全麦粉样品放入约50 mL小烧杯中，加入7．5 mL反应试剂(pH 6．0的磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液，10 mmol/L邻苯二酚)，恒温水浴振荡器上振荡5 min。振荡器速度设为100 r/min，温度设为37℃。迅速将反应后的样品放在冰块上终止反应(3 min)。终止反应的样品迅速混匀，4℃下10 000×g离心5 min。以反应试剂(邻苯二酚+缓冲液)为对照，在410 nm下测定上清液的吸光度ΔA(ΔA为5 min内吸光值的变化)。PPO活性计算公式为:PPO活性=103×ΔA值/5/0．3(每克全麦粉中 PPO的含量，用410 nm下每分钟吸光度改变量的1 000倍来表示)，单位为UA410。

1．2．3 添加剂存在条件下小麦PPO活性检测

称取0．300 0 g全麦粉样品放入约50 mL小烧杯中，加入7．5 mL反应试剂(pH 6．0的磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液，10 mmol/L邻苯二酚)，同时加入添加剂(柠檬酸、维生素C、蔗糖、亚硫酸氢钠、谷胱甘肽和铜试剂，缓冲液配制)至终浓度分别为0．1、0．2、0．4、0．6、0．8 mmol/L，其余操作按1．2．2 程序进行。以反应试剂(邻苯二酚+缓冲液)+添加剂(终浓度保持一致)为对照，在410 nm下测定上清液的吸光度ΔA(ΔA为5 min内吸光值的变化)。PPO活性计算及单位同 1．2．2。

2 结果与分析

2．1 添加剂对小麦PPO的抑制和激活效应

2．1．1 抑制(激活)倍数与抑制(激活)百分率

抑制(激活)倍数为加入添加剂后，PPO活性净减少(增加)部分与未加入添加剂PPO活性的比值;最大抑制(激活)倍数指，在同一添加剂浓度下，不同小麦品种中，数值最大的抑制(激活)倍数;平均抑制(激活)倍数指，在同一添加剂浓度下，所有小麦品种PPO活性抑制(激活)倍数的平均值;抑制(激活)百分率指，所有76份小麦品种中，其PPO活性被抑制(激活)的品种数占品种总数的百分比。本研究发现:最大抑制(激活)倍数受基因型的影响较大，而平均抑制(激活)倍数和抑制(激活)百分率受品种数目影响较大。从表1可以看出，亚硫酸氢钠、铜试剂、谷胱甘肽和维生素C对小麦PPO产生抑制效应，蔗糖和低浓度柠檬酸产生激活效应(激活效应不明显)，而高浓度柠檬酸产生抑制效应(抑制效应不明显)。亚硫酸氢钠在0．1～0．8 mmol/L浓度范围内对所有76个小麦品种PPO均产生了抑制效应，说明亚硫酸氢钠是一种PPO活性抑制效果较好的添加剂，但要注意添加量。亚硫酸氢钠、谷胱甘肽和维生素C对PPO的平均抑制倍数随浓度的增加而增大，说明浓度越高对PPO的抑制效果越好。铜试剂在0．4 mmol/L时对PPO的平均抑制倍数达到最大，随浓度增加先减小后增大。

表1 抑制、激活倍数及抑制、激活百分率

2．1．2 添加剂对小麦PPO活性的影响

从图1可以看出:柠檬酸和蔗糖对小麦PPO活性影响较小，前者在0．1～0．4 mmol/L以及后者在0．1～0．8 mmol/L范围内起激活效应，前者在0．6～0．8 mmol/L范围内起抑制效应，二者的抑制和激活效应均不明显。维生素C、亚硫酸氢钠、谷胱甘肽和铜试剂这四种添加剂对小麦PPO活性影响较大，均起抑制效应，且抑制效应十分明显。

图1 6种添加剂对小麦PPO活性的影响

2．2 添加剂浓度对抑制和激活效应的影响

由图1可知，柠檬酸和蔗糖的添加浓度对抑制、激活效应影响不明显。由表1可知，添加柠檬酸和蔗糖后，PPO活性在原始活性上下浮动，浮动幅度最大不超过4%。维生素C、谷胱甘肽、铜试剂和亚硫酸氢钠这四种添加剂随着添加浓度的增大，PPO活性明显降低，降低趋势与添加剂浓度呈对数关系，它们之间的对数关系式分别是:y1= －73．586ln(x1)+213．07，y2=－72．099ln(x2)+212．95，y3= －73．725ln(x3)+218．65，y4= －76．793ln(x4)+198．38，能分别解释添加剂浓度和PPO活性之间关系的86%，85%，75%，97%，且达极显著水平，如图2所示。维生素C和谷胱甘肽这两种添加剂对小麦PPO活性的抑制效果基本一致，而亚硫酸氢钠的抑制效果则比前两者强。铜试剂在0．4 mmol/L时对小麦PPO活性的抑制效果明显比其他浓度时的抑制效果好。

图2 添加剂浓度与PPO活性的关系

2．3 基因型对抑制和激活效应的影响

相对活力百分数为添加剂存在条件下的酶活力单位与无抑制剂条件下的酶活力单位之比。相对活力百分数大于1，说明相应的添加剂对PPO起激活效应;相对活力百分数小于1，说明相应的添加剂对PPO起抑制效应。相对活力百分数越大，其对PPO活性抑制效果越差，相反，相对活力百分数越小，其对PPO活性的抑制效果则越好。

以亚硫酸氢钠为例(图3)，不同的品种在同一浓度亚硫酸氢钠作用下，其相对活力百分数也不同，相对活力百分数变化较大，说明基因型对抑制效应影响明显，其原因可能是PPO种类不同，控制合成PPO的基因不同，即存在一个质的问题;同一品种在不同浓度亚硫酸氢钠作用下，其相对活力百分数也不同，多数品种相对活力百分数变化较大，少数品种相对活力百分数变化较小，可能是因为品种不同，其所含PPO的量也不同，即存在一个量的问题。同一品种在不同添加剂作用下，其相对活力百分数不同;不同品种在相同添加剂作用下，其相对活力百分数也不同;柠檬酸和蔗糖作用下的76个品种的PPO相对活力百分数在1．0上下浮动，而维生素C、谷胱甘肽和亚硫酸氢钠作用下的76个品种的PPO相对活力百分数在0．5上下浮动(图4)。图3、图4说明抑制和激活效应均受基因型的影响，影响程度因基因型而异。

3 结论

小麦粉中PPO是引起面制食品产生褐变的重要因素之一，通过添加剂来控制PPO活性是方便、快捷而又十分有效的方法。

3．1 亚硫酸氢钠、铜试剂、谷胱甘肽和维生素C对小麦PPO产生抑制效应，蔗糖和低浓度柠檬酸产生激活效应(激活效应不明显)，而高浓度柠檬酸产生抑制效应(抑制效应不明显)。维生素C和谷胱甘肽这两种添加剂对小麦PPO活性的抑制效果基本一致，而亚硫酸氢钠的抑制效果则比前两者强。

3．2 维生素C、谷胱甘肽、铜试剂和亚硫酸氢钠的添加浓度与PPO活性呈对数关系，其对数关系式分别为:y1= － 73．586ln(x1)+213．07，y2= － 72．099 ln(x2)+212．95，y3= －73．725ln(x3)+218．65，y4=－76．793ln(x4)+198．38，能分别解释添加剂浓度和PPO活性之间关系的86%，85%，75%，97%，且达极显著水平。

3．3 亚硫酸氢钠、铜试剂、谷胱甘肽和维生素C是较理想的小麦PPO活性抑制剂，而谷胱甘肽和维生素C可

考虑作为抑制小麦PPO活性的“绿色”“食品添加剂。3．4 小麦PPO的抑制和激活效应同时受添加剂种类、添加剂浓度和基因型影响。

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Inhibition and Activation Effects of Different Additives on Wheat PPO Activity

Si Hongqi Feng Jiming Lu Jie Ma Chuanxi
(Anhui Provincial Wheat Area Tech－nology Innovation Centre of Ministry of Agriculture Wheat Industry Engineering Tech－nology Research Centre of Anhui Province Key Laboratory of Plant Molecular Breeding of Ministry of Education School of Agronomy of Anhui Agricultural University，Hefei 230036)

Seventy － six wheat cultivars were selected as the experimental materials，and polyphenol oxidase(PPO)was extracted by citric acid － phosphate buffer from their whole wheat flour．Six chemical reagents selected as PPOinhibitors and activators were put into the enzymical extract，and then PPO activity was determined using spectrophotometer．The results showed that:the inhibition and activation were influenced by kinds，concentration of additives and wheat cultivars;sodium hydrogen sulfite，sodium diethyldithiocarbamate，glutathione and vitamin C had the inhibition on wheat PPO，and the sucrose and lower concentration citric acid had unobvious activation．However，higher concentration citric acid had unobvious inhibition and the inhibition of sodium hydrogen sulfite was stronger than vitamin C and glutathione;it was presented for logarithmic relationship between wheat PPO activities and concentrations of vitamin C，glutathione，sodium diethyldithiocarbamate and sodium hydrogen sulfite;Glutathione and vitamin C could be used as the food additives to inhibit wheat PPO activity．

wheat，polyphenol oxidase，additive，inhibitor，browning，color

S512．1

A

1003－0174(2011)07－0006－04

国家科技支撑计划(2009BADA6B01)，现代农业产业技术体系专项经费，安徽省良种优质化专项(08010 301065)，安徽农业大学科研启动基金(wd2008－10)

2010－08－18

司红起，男，1972年出生，副教授，小麦品质改良及分子育种

马传喜，男，1963年出生，教授，小麦品质改良及分子育种