三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

巩 芳，尹震花，顾雪竹，顾海鹏，康文艺＊

（1.河南大学 中药研究所，河南 开封475000；2.中国中医研究院 中药研究所，北京100700）

三白草Saururus chinensis（Lour.）Baill为三白草科三白草属植物，别名塘边藕，产于河北、山东、河南和长江流域及其以南各省区，生于低湿沟边、塘边或溪边。日本、菲律宾及越南也有分布。全株药用，内服治疗尿路感染、尿路结石、脚气水肿及营养性水肿；外敷治疗痈疮疖肿、皮肤湿疹等［1］。国内外学者［2－7］对其研究发现，三白草中有挥发油、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质等化学成分。药理研究发现，其具有抗炎［8－9］、降 血 糖［10－13］、解 毒、抗 菌、抗 氧 化［14－16］、保肝［17－18］、利尿等药理作用。

α－葡萄糖苷酶抑制剂可竞争性抑制小肠内α－葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收，从而有效缓解餐后高血糖。由于其独特的优势，目前已被广泛用于糖尿病及其并发症的防治，临床上主要使用阿卡波糖和伏格列波糖等。国内外对三白草的降血糖作用已有报道，但是主要集中在体内的研究，未见文献对α－葡萄糖苷酶抑制活性的报道。我们利用体外抑制α－葡萄糖苷酶模型，首次对三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性进行研究。

1 仪器与材料

Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Electron公司）；LRH-150恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；DELTA 320型pH 计（美国 Mettler Toledo公司）；电子天平（美国Mettler Toledo公司）；旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；TGL-16高速离心机（江苏金坛市中大仪器厂）。

α-葡萄糖苷酶 （α－glucosidase，EC 323-604-7），4－硝 基 苯－α-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷 （4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026-K1516），阿 卡 波 糖（Acarbose，Lot 16869），二甲亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；其他试剂均为分析醇。

三白草于2010年7月采集于河南省新县大别山区，由河南大学中药研究所李昌勤副教授鉴别为三白草科三白草属植物三白草Saururu chinensis（Lour.）Baill，标本存于河南大学中药研究所。

2 实验部分

2.1 三白草浸膏的提取

将三白草全草阴干，粉碎，用甲醇室温下浸泡3次，每次3d，合并提取滤液后浓缩，得到甲醇总浸膏。总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩得到三白草石油醚部位（SBPE）、乙酸乙酯部位（SBEA）、正丁醇部位（SBBU）。

2.2 α－葡萄糖苷酶抑制活性的筛选方法

2.2.1 标准曲线制作 根据采用的反应体系，用磷酸缓冲液 （pH 6.8）配制1 000μmol／L PNP，稀释成400、300、200、150、100、50、25、5、0μmol／L。分别取7种不同浓度的PNP溶液各160μL，加入0.2μmol／L Na2CO3溶液80μL，混匀，在405nm下测定OD值，测3组，取平均值。以OD值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，做出标准曲线。

2.2.2 α－葡萄糖苷酶活力的测定 根据所采用的反应体系，112μL磷酸钾缓冲液（pH 6.8）加入200U／L α-葡萄糖苷酶20μL 、DMSO 8μL，37℃ 恒温，15min后加入2.5mmol／L PNP 20μL，摇匀，37℃恒温反应15min，再加入0.2mol／L Na2CO3溶液80μL，于405nm波长下测OD值。

酶活力单位定义：37℃、pH 6.8条件下，1min水解底物所产生1μmol对硝基苯酚的酶量，规定为1个酶活力单位（U）［19］。

2.2.3 检测方法 将三白草各提取物以DMSO溶解，并存储于4℃ 冰箱中。以张丽等［20－22］建立的96微孔板筛选方法，405nm处检测其OD值，同时做相同体系下的样品空白组，不加样品、酶与底物的空白对照组，不加样品的阴性对照组和以阿卡波糖为抑制剂的阳性对照组，并用Origin软件求出相应的IC50值。

酶活性抑制率（%）＝（OD样品阴性－OD样品空白）／（OD 阴性－OD 空白）×100%。

3 结果与讨论

3.1 三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

3个提取物中，乙酸乙酯部位（IC50＝122.7mg／L）α－葡萄糖苷酶抑制活性最高，其次为石油醚 部 位 （IC50＝203.3mg／L）和 正 丁 醇 部位（IC50＝659.9mg／L），3个提取物活性均远高于阳性对照组阿卡波糖（IC50＝1 103.01mg／L），表明三白草提取物具有好的α－葡萄糖苷酶抑制活性，见表1。

表1 三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

初筛时，在同一质量浓度下（1 500mg／L），三白草3个提取物α－葡萄糖苷酶抑制率从大到小依次为石油醚部位＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位，且初筛抑制率均高于阳性对照组阿卡波糖。但是，初筛时抑制率大，IC50值不一定大，由此可见，仅从抑制率评价其活性并不可靠，应结合IC50值综合判断。为进一步研究抑制活性，对三白草提取物的初筛浓度依次对半稀释，并进行IC50计算，见图1。

图1 三白草不同提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性

3.2 提取物质量浓度对α－葡萄糖苷酶抑制活性的影响

三白草3种提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性均随浓度增加而增加，呈浓度依赖性。三白草石油醚部位和乙酸乙酯部位，在质量浓度为300mg／L时，抑制率已经达到73.38%和74.45%，此后再增加提取物浓度，抑制活性缓慢增加；正丁醇部位α－葡萄糖苷酶抑制活性几乎随浓度增加而增加，见图2。

图2 提取物质量浓度对α－葡萄糖苷酶抑制活性的影响

4 结论

我们采用α－葡萄糖苷酶体外抑制模型对三白草提取物α－葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，发现三白草提取物均具有一定的α－葡萄糖苷酶抑制活性，且提取物的活性高于阳性对照组阿卡波糖。另外，各提取物的抑制活性均与浓度呈正相关性，说明其抑制活性具有浓度依赖性。

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