北虫草体外抗氧化和PC12氧化损伤修复作用的有效部位的筛选

杜秀菊，张秀省，张劲松，贾 薇，刘艳芳，杨 焱，唐庆九，周 帅

1聊城大学生命科学学院，聊城252059;2国家食用菌工程技术研究中心国家食用菌加工技术分中心上海市农业科学院食用菌研究所，上海201106;3聊城大学农学院，聊城252059

北虫草体外抗氧化和PC12氧化损伤修复作用的有效部位的筛选

杜秀菊1，2，张秀省3，张劲松2*，贾 薇2，刘艳芳2，杨 焱2，唐庆九2，周 帅2

1聊城大学生命科学学院，聊城252059;2国家食用菌工程技术研究中心国家食用菌加工技术分中心上海市农业科学院食用菌研究所，上海201106;3聊城大学农学院，聊城252059

采用系统溶剂法对北虫草子实体进行依次提取，制备得氯仿相、乙酸乙酯相和乙醇相三部位，利用化学发光法和H2O2诱导PC12氧化损伤修复模型，对三部位进行体外抗氧化活性和PC12氧化损伤修复作用测定。结果表明，乙酸乙酯相具有较强的抗氧化活性，是清除H2O2自由基和超氧自由基活性最强的部位，IC50值分别为88.5 μg/mL和190 μg/mL;乙酸乙酯相对由H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的修复作用较强，且呈现明显的浓度依赖性。无论从抗氧化活性，还是从对H2O2氧化损伤的修复作用，乙酸乙酯相均表现出了较强的作用，乙酸乙酯相是抗氧化活性和保护PC12细胞氧化损伤的主要有效部位。

北虫草;抗氧化;PC12细胞;氧化损伤;系统溶剂法

传统野生的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的生长不仅需要特殊的生境，还具有严格的寄生性，所以自然资源极度匮乏，被列为一级保护物种，价格堪比黄金，无法满足社会需求。和C.sinensis同属异种的北虫草(C.militaris)，是虫草属的模式种，又称北冬虫夏草，蛹虫草等，是寄生在鳞翅目和鞘翅目等昆虫蛹体上的真菌，研究表明，两者的化学成分、营养成分和药理功能均非常相似，因而可以作为冬虫夏草的最佳替代品［1］。研究表明，北虫草具有抗肿瘤［2］、增强免疫功能［3］、抗氧化［4］、抗疲劳［3］、抗菌抗病毒［5］等多种生理功能，开发北虫草及其活性成分具有很高的经济价值和社会效益，已引起诸多国内外同行的广泛关注。

本研究利用化学发光法和H2O2诱导的PC12氧化损伤修复模型，对系统溶剂法提取制备得到的氯仿相、乙酸乙酯相、乙醇相等三个部位进行了抗氧化活性和氧化损伤修复活性的系统筛选，本试验结果将对科学开发利用北虫草资源奠定一定的理论基础。

1 材料和试剂

北虫草子实体，由上海农业科学院食用菌研究所提供。

DMEM高糖培养基、胎牛血清、马血清、DMSO (二甲亚砜)购自GIBCO公司;鲁米诺、邻苯三酚和NGF购自Sigma公司;链霉素、青霉素购自Amersco公司;Alamar Blue购自Biosource公司;其它均为国产分析纯。

2 方法

2.1 北虫草子实体的提取

称取北虫草子实体干品100 g，粉碎机粉碎，60目过筛，氯仿68℃回流2 h，收集上清浓缩干燥得氯仿相(CHCl3相，命名为CMCl);沉淀挥干氯仿后，加乙酸乙酯78℃回流2 h，上清浓缩干燥得乙酸乙酯相(EtOAc相，命名为CMEtOAc);沉淀挥干乙酸乙酯后，加95%的食用酒精90℃回流2 h，上清浓缩干燥得乙醇相(EtOH相，命名为CMEtOH)。

2.2 抗氧化试验

2.2.1 样品制备

精确称取5 mg样品，置于灭过菌的eppendorf管中，用1mL PBS缓冲液使之充分溶解。10000 r/ min离心30 min，无菌条件下收集上清，再将样品分别稀释成浓度分别为10、20、40、60、80、100、1.0 mg/ mL和2.0 mg/mL等备用。

2.2.2 超氧阴离子(O-·2)清除试验［6］

先于96孔板注入2 μL不同浓度的样品溶液［空白对照和阳性对照分别以等量 0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液和超氧化物歧化酶(SOD)］，然后加入8 μL 6.25×10-4mol/L邻苯三酚，由外部泵入150 μL鲁米诺和碳酸钠缓冲液混合液，每孔每0.6 s收集一次光信号，连续收集30 s，记录相对发光强度。每个样品设3次重复。超氧自由基清除率按下面的公式计算。

A0为空白的发光峰值，A1为加入样品反应后的发光峰值。

2.2.3 过氧化氢(H2O2)清除试验［6］

用Clarity化学发光仪(BIO-TEK公司)进行测定。96孔板中每孔先注入10 μL H2O2溶液，再注入40 μL不同浓度的样品溶液［空白对照和阳性对照分别以等量K2HPO4-KH2PO4缓冲液和Vc(Vitamin C)代替样品］，再注入150 μL鲁米诺和碳酸钠缓冲溶液混合液。每孔每0.6 s收集一次光信号，连续收集30 s，记录相对发光强度。每个样品设3次重复。H2O2自由基清除率计算公式同超氧自由基清除率计算公式。

2.3 对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的修复试验［6］

2.3.1 样品制备

精确称取1 mg样品，充分溶解于1mL DMSO缓冲液中。10000 r/min离心30 min，无菌条件下收集上清，再用DMSO分别将样品稀释成10、50 μg/mL和200 μg/mL备用。

2.3.2 DMEM培养液的配制

在高糖DMEM培养基中加入15%胎牛血清、2.5%马血清、1×10 U/L青霉素和1×10 U/L链霉素，摇匀后备用。

2.3.3 氧化损伤修复试验

PC12细胞(由中国科学院上海药物研究所丁侃研究员惠赠)接种于DMEM培养液中，于37℃、5%的CO2培养箱中培养至对数生长期，取出，离心(1000 r/min，3 min)，底部细胞用培养液稀释为2× 104 cell/mL，于96孔板中每孔接种190 μL，加入10 μL H2O2处理液(阴性对照不加)，处理4 h后，吸去96孔板中所有培养基，每孔加入 199 μL新鲜DMEM培养液，然后每孔加入待测样品。试验分为四组，具体方案如下:

(1)样品组:199 μL DEME+PC12细胞 +1 μL样品(经H2O2处理);

(2)阴性对照组:199 μL DEME+PC12细胞+1 μL DMSO(未经H2O2处理);

(3)阳性对照组:199 μL DEME+PC12细胞+1 μL NGF(经H2O2处理)，NGF浓度为100 μg/mL;

(4)损伤对照(H2O2作用组M):199μL DEME +PC12细胞+1μL DMSO(经H2O2处理)。

加好样品的96孔板继续放入37℃，含5%的 CO2培养箱中培养48 h后，观察细胞形态，并用AlamarBlue Assay检测细胞存活率［12］。该试验重复三次，只采用H2O2作用组损伤程度在40%～60%的试验数据。存活率根据如下公式计算:

存活率(%)=［117216×Aλ570(sample)-80856 ×Aλ600(sample)］/［117216×Aλ570(control)-80856 ×Aλ600(control)］×100%

2.4 统计学分析

使用STST统计软件包进行方差统计分析，n=3。

3 结果与分析

3.1 北虫草子实体各部位的提取得率

北虫草子实体三部位提取物经干燥至恒重后称重，计算后得知:CMCl、CMEtOA和CMEtOH的得率分别为0.83%、1.19%和4.22%，结果表明，EtOH相得率最高，EtOA相次之，CHCl3相最低。

3.2 子实体不同提取部位的抗氧化活性

北虫草子实体不同提取部位对O-·2的清除结果如图2所示。图2表明，北虫草子实体的三个部位对超氧自由基都有清除能力，其中CMEtOA的清除能力较强，CMEtOH次之，CMCl较差。

表1列出了北虫草子实体不同提取部位的抗氧化活性的IC50值。由表1可以看出:CMEtOA、CME-tOH和CMCl的IC50分别为190、258 μg/mL和3.88 ×103μg/mL，表明CMEtOA和CMEtOH对超氧自由基都有较高的清除能力，CMEtOA的清除活性略高于CMEtOH，CMCl清除超氧自由基的能力最差，与CMEtOA相比较，呈现极显著差异(P＜0.01)。

图1 北虫草子实体不同提取物对超氧自由基的清除率Fig.1 The scavenging rate of Oof the three extracts from C.militaris fruiting bodies

北虫草子实体三部位对H2O2自由基的清除结果如图3和表1所示。图3表明，三部位对H2O2自由基都有清除能力，其中CMEtOA较强，CMCl次之，CMEtOH较差。它们的IC50值(见表1)表明: CMEtOA的最低，为88.5 μg/mL，其次为CMCl(227 μg/mL)，CMEtOH的最高(544.7 μg/mL)。因此，清除H2O2自由基的活性为:CMEtOA＞CMCl＞CMEtOH，三者清除H2O2自由基的活性呈现极显著差异(P＜0.01)。

图2 北虫草子实体不同提取物对H2O2自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

表1 北虫草子实体不同提取物对超氧自由基和H2O2自由基的清除效果(IC50值)Table 1 Antioxidant effect(IC50)of Oand H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

表1 北虫草子实体不同提取物对超氧自由基和H2O2自由基的清除效果(IC50值)Table 1 Antioxidant effect(IC50)of Oand H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

1Vc在清除H2O2试验中用于阳性对照;2SOD(超氧化物歧化酶)在清除超氧阴离子试验中用于阳性对照。1Vc(Vitamin C)was used as positive control in H2assay;2SOD(Superoxide Dismutase)was used as positive control in Oassay.

IC50(μg/mL)样品Sample 227 CMEtOA 190 88.5 CMEtOH 258 544.7维生素C(Vc)1 - 22.3超氧化物歧化酶(SOD)2 3.7×10-2 assay CMCl 3.88×103 O-· 2 assay H2O2 -

3.3 北虫草子实体不同提取物对 H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的修复作用

北虫草不同部位的提取物对PC12细胞的氧化损伤的修复作用结果见表2。PC12细胞经过氧化剂H2O2处理后，H2O2作用组的细胞存活率下降到了(43.56±2.5)%，阳性对照NGF在0.1 μg/mL时的修复率为(98.03±1.3)%，阳性对照NGF和样品组的细胞存活率均高于H2O2作用组的细胞存活率，表明了样品对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤都有不同程度的修复作用。CMEtOA和CMCl呈现浓度-效应正相关，表明对H2O2诱导的氧化损伤的修复作用随着浓度升高而增强;CMEtOH当浓度为10 μg/mL增至50 μg/mL时，PC12细胞的存活率由(61.98±0.8)%上升到(65.44±2.1)%，呈现明显的剂量-效应正相关，但当浓度增至200 μg/mL时，细胞存活率反而下降到了(58.76±1.7)%，表明CMEtOH组分内有可能含有抑制氧化损伤修复作用的组分，需要对其进一步分离纯化研究后确定。三部位相比较，CMEtOA的细胞存活率最高，在10 μg/mL、50 μg/mL和200 μg/mL时的细胞存活率分别为(70.02±1.2)%、(80.57±2.5)%和(85.37± 3.0)%，呈现明显的浓度依赖性。在200 μg/mL时，CMEtOA的细胞存活率与CMCl相当，二者与CMEtOH相比，呈现极显著差异(P＜0.01)。综上所述，CMEtOA对由H2O2诱导的PC12细胞损伤具有明显的修复作用，CMCl稍次之，CMEtOH最差。

表2 北虫草不同提取物对PC12细胞的氧化损伤修复作用Table 2 Rehabilitation effect of PC12 cell of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

4 讨论与结论

4.1 食、药用真菌是产生天然活性化合物的天然宝库。天然的抗氧化剂是一类重要的生物活性物质，可以清除人体代谢过程中产生的自由基，具有延缓机体衰老之功效。不但可以作为食品添加剂，也可以用于化妆品行业，无论在国内还是在国外受到越来越多的青睐。本研究利用化学发光法，对北虫草子实体的三个不同提取部位进行了抗氧化活性的筛选，试验结果表明，三个部位(CHCl3相、EtOAc相和EtOH相)均有抗氧化活性，其中EtOAc相是清除H2O2自由基的最主要的活性部位(IC50值为88.5 μg/mL)，也是清除超氧自由基的最主要的活性部位(IC50值为190 μg/mL)，在同一试验浓度下，EtOAc相对H2O2自由基的清除率高于对超氧自由基的清除率。EtOAc相抗氧化的有效成分还有待于进一步分离纯化后确定。

4.2 据报道［7］，本研究用作阳性对照的神经生长类物质(NGF，神经生长因子)对损伤神经具有较强的修复作用，但这类营养因子往往取自动物机体，数量极少所以价格昂贵。目前已发现猴头［8］、鸡枞［9］和灵芝［10］等食药用菌中，均含有神经营养成分的有效成分。北虫草子实体对神经保护作用的研究较少有报道。本研究利用本实验室成功建立的体外模拟自由基损伤诱导细胞凋亡的模型，以北虫草子实体不同部位的提取物为研究材料，评价了受试样品对H2O2诱导的PC12氧化损伤修复作用，试验结果表明，EtOAc相能明显促进H2O2诱导损伤后的PC12增殖，且呈现明显的剂量-效应关系，200 μg/mL时的细胞存活率为(85.37±3.0)%，明显高于H2O2作用组，且与EtOH相比呈现极显著差异(P＜0.01)，因此，EtOAc相对H2O2诱导的PC12细胞的氧化损伤具有明显的修复作用，是具有氧化损伤修复作用的有效部位。

4.3 综上所述，无论是从抗氧化活性，还是从氧化损伤修复活性的角度，EtOAc相均表现出了较强的作用。庞小博［7］(2009)提到氧化损伤修复的有效成分不一定是抗氧化物质，本研究试验结果表明，北虫草的抗氧化活性部位和氧化修复活性部位均为EtOAc相，二者达到了统一，当然它们的有效成分未必是同一种物质，因为本试验中，EtOAc相是指溶解于乙酸乙酯的所有物质的混合物。所以接下来的工作重点将是:以生物活性作为跟踪指标对其进一步分离纯化，以期得到活性最强的有效成分的单体。

至于EtOAc相中的有效成分究竟通过何种途径促进氧化损伤的PC12神经细胞的增殖作用，亦将有必要做进一步的探讨。

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Antioxidant Activity and Oxidative Injury Protection for PC12 of Three Extracts from Cordyceps militaris Fruiting Bodies in vitro

DU Xiu-ju1，2，ZHANG Xiu-sheng3，ZHANG Jing-song2*，JIA Wei2，LIU Yan-fang2，
YANG Yan2，TANG Qing-jiu2，ZHOU Shuai21College of Life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China;2National Engineering Research Center of Edible Fungi;National R＆D center for edible fungi processing;Edible Fungi Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China;3College of Agricultural Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China

Cordyceps militaris fruiting bodies were extracted by using the method of systematic solvent extraction，and three different extracts were prepared named chloroform extract，acetic ether extract and ethanol extract，respectively.In vitro，the antioxidant activities of different extracts were investigated by using chemiluminescence measurements，and the activities of oxidative injury protection were assessed by using PC12 oxidative injury model induced with H2O2.The superoxide free radical(O－·2)system and H2O2system assays showed that the acetic ether extract had notable antioxidant activity，their scavenging rate for both H2O2and O－·2were highest among the three extracts，whose IC50were 88.5 μg/ mL and 190 μg/mL，respectively.Moreover，the oxidative injury protection for PC12 assay showed that the acetic ether extract had significant rehabilitation effect in comparison with chloroform extract and ethanol extract，and it rehabilitated PC12 cell treated with H2O2in a dose-dependent manner.Therefore，it was concluded that the acetic ether extract was the principal extract of both antioxidant and the activity of oxidative injury rehabilitation among three extracts from C.militaris fruiting bodies.

Cordyceps militaris;antioxidant activity;PC12 cell;oxidative injury;systematic solvent extraction

1001-6880(2011)05-0905-05

2010-12-29 接受日期:2011-05-11

国家科技部支撑基金项目(2006BAD06B08)

*通讯作者 E-mail:zhangjs8888@yahoo.com.cn

R284.2

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