提取工艺和植物生长调节剂对罗布麻愈伤组织中黄酮含量的影响

刘小锐，计巧灵，苗书魁，邢思雷

新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046

提取工艺和植物生长调节剂对罗布麻愈伤组织中黄酮含量的影响

刘小锐，计巧灵*，苗书魁，邢思雷

新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046

以罗布麻愈伤组织粉末为材，在单因素实验的基础上，利用响应曲面法对罗布麻愈伤组织中黄酮的提取工艺进行优化。响应曲面分析结果表明，提取试剂和提取温度对提取的黄酮含量存在显著影响。通过响应曲面分析得到罗布麻愈伤组织中黄酮提取的最佳条件为:提取试剂为70%甲醇，物料比1∶40，提取时间为4 h，提取温度为70℃。培养并比较了30种不同植物生长调节剂浓度与配比诱导100 d生长的愈伤组织中黄酮的含量，结果得出MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)上培养约100 d的愈伤组织中黄酮含量最高，为73.90 mg/g。测定愈伤组织培养30 d内黄酮的积累动态，探明从培养的愈伤组织提取黄酮的最佳时段。通过优化提取工艺和筛选最佳植物生长调节剂浓度与配比，运用组织培养技术提高了罗布麻愈伤组织中黄酮含量。

罗布麻;黄酮;愈伤组织;提取工艺;植物生长调节剂

罗布麻(Apocynum venetum L.)别名野麻、泽漆麻、茶叶花等［1］，属夹竹桃科多年生直立草本植物［2］，分布于我国新疆、青海、甘肃、河北等西北盐碱和沙漠地区［3］，在新疆的阿克苏地区、塔里木河、孔雀河畔和罗布泊的资源较丰富［4］，但近年野生面积迅速在缩减。罗布麻是一种名贵的中草药，收载于1977年、1985年、1990年和2005年的《中华人民共和国药典》之中［5，6］。现代研究表明，罗布麻的主要活性成分为黄酮类化合物［7］，其药用和保健功效与其富含的黄酮类成分密切相关，罗布麻叶中主要含有金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、芸香苷、槲皮素等黄酮类成分［8］，具有降压、降血脂、保肝和抗脂质过氧化等作用［9］。因此，为了保护罗布麻野生资源，也为了探索应用生物技术生产罗布麻有效成分，本文以罗布麻愈伤组织为材，采用响应曲面优化法优化了总黄酮的提取工艺，比较了在不同植物生长调节剂浓度与配比诱导下生长的愈伤组织中的黄酮含量，旨在探索通过罗布麻组织培养技术生产高产量黄酮的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

罗布麻种子于2008年9月采自新疆精河县火车站以西的沙质戈壁。种子用0.1%升汞(加1～2滴吐温-20)消毒1 min，再用无菌水漂洗4～6次。将灭菌的种子接种到未附加植物激素的MB培养基上进行暗培养。种子发芽生长约10 d，无菌条件下取下胚轴，切成0.6 cm左右长，置于附加不同浓度与组合的2，4-D、6-BA、KT、NAA四种植物生长调节剂(表6)的MB培养基上，进行愈伤组织的暗诱导并继代培养三次(每次30 d)，培养基蔗糖浓度为30 g/L、琼脂7 g/L、pH值为5.8。培养温度为24±2℃，光照周期为12 h，继代时光照强度为2500 μmol photos/m·s。将得到的愈伤组织在常温下晾干，研成粉末，并过40目筛待测。

1.2 仪器与设备

水浴锅;AL104电子天平(METTER TOLEDO); Spectrumlab 53紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)等。

1.3 试剂

甲醇;乙醇;NaNO2;Al(NO3)3;NaOH(均为分析纯);芦丁标准品(色谱纯)购于西安沃尔森生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 黄酮标准曲线的绘制

准确称取12.5 mg的芦丁标准品于25 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，浓度为0.5 mg/mL(储备液Ⅰ)。分别从储备液Ⅰ中准确吸取0、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL和5.0 mL于25 mL的容量瓶中，加水少许，再加5%的NaNO20.7 mL，摇匀，5 min后加10%Al(NO3)30.7 mL，摇匀，5 min后再加入1 mol/L NaOH 4 mL，加水至刻度，10 min后在510 nm处测定吸光值。以芦丁的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程:y=10.46x-0.0002，R2=0.9996，芦丁浓度在0～0.1 mg/mL范围内呈现良好线性关系。

1.4.2 罗布麻愈伤组织中总黄酮的提取

根据表1设计的提取试剂、料液比、提取时间和提取温度四个试验测定0.100 g愈伤组织粉末中黄酮含量，应用响应曲面法优化总黄酮提取工艺。

分别准确称取各种处理的愈伤组织粉末0.100 g置于试管中，在最佳提取条件下用水提醇沉法提取愈伤组织中总黄酮，在提取时间到达一半时取出过滤，再加入同等剂量的溶剂继续提取，最后过滤，合并滤液，容量瓶分别定容至10 mL。

1.4.3 总黄酮含量的测定

准确吸取上述滤液1.00 mL，加入到25 mL容量瓶中，按测黄酮标准曲线的方法在510 nm处测定吸收值，测三次取平均值。将吸收值代入总黄酮的标准曲线方程求出罗布麻愈伤组织中含有的总黄酮量。

2 结果与分析

2.1 响应曲面法对提取罗布麻愈伤组织中黄酮工艺的优化

单因子实验结果，试验按上述“1.4.2”项和“1.4.3”方法测定黄酮含量。试验材料为在MB+KT (0.2 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)培养基上诱导并继代的愈伤组织粉末。试验顺序为在进行完试验一之后，确定最佳的提取试剂，再进行试验二。在最佳试剂的条件下摸索最佳的料液比，再进行试验三，得出最佳的提取时间，最后在前三个最佳的条件下进行试验四得到最适的提取温度。详细的结果见图1～5。

表1 试验步骤及结果Table 1 experimental process and results

四70%甲醇 1∶30 4 h 40、50、60、70、75、80℃ 最佳提取温度为75℃

图5 提取温度对黄酮含量的影响Fig.5 Effects of temperature on flavonoids content

2.2 响应曲面对总黄酮提取工艺的优化

利用Minitab15软件，根据Box-Behnken设计原理，以提取试剂(A)，物料比(B)，提取时间(C)及提取温度(D)四个因子为自变量，以提取的总黄酮含量为响应值设计四因素三水平共28个实验点的响应面分析实验，每个试验因素的水平选取如下:

表2 响应面分析因子及水平表Table 2 Factors and levels of RSM analysis

实验以随机次序进行，每个实验重复三次，得到的响应值平均后用Minitab15软件进行分析，并得出响应面/等值线图，方差分析表。响应面设计及结果见表3.

表3 实验方案及结果分析Table 3 Design and results of tests

9 0 0 1 -1 44.50 10 0 1 1 0 50.48 11 1 -1 0 0 39.25 12 0 0 1 1 36.14 13 -1 -1 0 0 45.28 14 0 1 -1 0 46.44 15 0 0 -1 -1 42.59 16 0 -1 1 0 48.33 17 0 0 0 0 42.14 18 -1 0 -1 0 45.23 19 1 0 -1 0 45.47 20 0 1 0 1 35.90 21 0 -1 0 1 35.43 22 0 0 0 0 42.59 23 -1 1 0 0 46.18 24 0 -1 -1 0 46.18 25 0 0 0 0 43.00 26 0 1 0 -1 51.92 27 -1 0 1 0 48.80 28 1 0 0 1 35.74

表4 参数估计Table 4 Parameter estimates

表5 回归分析结果Table 5 Results of regression analysis

由表4可以得出，对总黄酮含量影响的程度由大到小依次为提取温度＞提取试剂＞物料比＞提取时间。其中提取温度的影响最为显著(P＜0.05)。由表5可以知道，失拟项P=0.057＞0.05，说明在P=0.05水平上不显著，模型与实验值的差异性较小，模型拟合情况好。响应曲面图和等值线图详见附表图6-图11。由响应曲面分析结果可以得出，用水提醇沉法提取总黄酮的最佳条件为提取试剂为70%甲醇，料液比1∶40，提取时间4 h，提取温度为70℃。

2.3 黄酮在愈伤组织中的积累动态

将无菌下胚轴在培养基MB+2，4-D(0.1 mg/ L)+6-BA(0.5 mg/L)上暗诱导并继代，在第一次继代培养时，每3 d收集愈伤组织，并测定其黄酮含量。30 d后统计分析数据，经测定发现，黄酮在罗布麻愈伤组织中的积累如图12所示，黄酮含量在罗布麻愈伤组织中的积累基本呈‘S’型，前6 d黄酮含量增长较缓，第7～12 d增长很快，第15 d黄酮含量达到最大值，随着培养时间的延长，黄酮的含量逐渐降低。由此得出，从培养的罗布麻愈伤组织中生产黄酮的最佳时段为15 d.

图12 黄酮含量在愈伤组织中的积累动态Fig.12 The accumulatiive dynamic state of flavonoids content in callus

2.4 植物生长调节剂对罗布麻愈伤组织中总黄酮含量的影响

由表6可见，不同的植物生长调节剂配比对愈伤组织中黄酮含量有显著影响。在6-BA和2，4-D组合中，随着6-BA和2，4-D的增高，黄酮含量也逐渐增加，当2，4-D的浓度达到0.5 mg/L、6-BA为2.0 mg/L时，黄酮含量最大，达到52.63 mg/g;在6-BA和 NAA组合中，1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA诱导的愈伤组织中黄酮含量最高，达到56.93 mg/g。其中，黄酮含量最高的愈伤组织诱导条件为:MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)，总黄酮的含量为73.90 mg/g。

表6 不同植物激素对黄酮含量的影响Table 6 The influence of flavonoids content with different growth regulor

4 0.1 2.0 0 0 17.97 5 0.5 1.0 0 0 21.80 6 0.5 1.5 0 0 28.49 7 0.5 2.0 0 0 52.63 8 1.0 3.0 0 0 19.41 9 2.0 5.0 0 0 11.52 10 0 0.3 0 0.1 50.48 11 0 0.5 0 0.1 52.39 12 0 1.0 0 0.1 39.96 13 0 1.5 0 0.1 38.05 14 0 2.0 0 0.1 50.24 15 0 1.0 0 0.5 56.93 16 0 1.5 0 0.5 48.81 17 0 2.0 0 0.5 56.45 18 0 0 0.2 0.2 51.91 19 0 0 0.5 0.2 65.30 20 0 0 1.0 0.2 73.90 21 0 0 2.0 0.2 67.21 22 0 0 3.0 0.2 61.23 23 0 0 4.0 0.2 42.83 24 0 0 5.0 0.2 62.19 25 0 0 0.5 0.5 40.93 26 0 0 1.0 1.0 67.69 27 0 0 2.0 2.0 53.59 28 0 0 3.0 3.0 64.58 29 0 0 4.0 4.0 42.83 30 0 0 5.0 5.0 37.81

植物生长调节剂不仅是影响细胞生长、分化的主要因素，也是影响细胞次生代谢物积累的重要因素。据研究报道，生长素类物质如2，4-D和NAA可以诱导早S期细胞的端粒酶活性增强，有利于稳定细胞的分裂能力，减缓细胞衰老［10］。培养基中添加细胞分裂素类调节剂如6-BA、KT，能增加愈伤组织中分生细胞数，有利于细胞数量和愈伤组织体积增加［10］。据姜玲等报道，以银杏幼叶诱导的愈伤组织进行细胞悬浮培养发现，KT与NAA组合，NAA与6-BA组合均能使细胞干重和黄酮糖苷含量同时提高［11］。本文研究结果表明，将KT和NAA配合使用，既有利于细胞增殖，也有利于次生代谢物的积累，印证了姜玲等人的结果。本文通过优化从罗布麻愈伤组织提取总黄酮的工艺和筛选最佳植物生长调节剂浓度与配比，为利用组织培养技术提高罗布麻愈伤组织中总黄酮含量奠定了基础。

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Effect of Extraction Process and Plant Growth Regulators on Flavonoids Content in Callus of Apocynum venetum

LIU Xiao-rui，JI Qiao-ling*，MIAO Shu-kui，XING Si-lei
College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China

Optimization of flavonoids extraction process carried out in callus of Apocynum venetum through the response surface method after single factor was studied.The method indicated that there were significant effects to flavonoids content in extracting reagent and temperature.The optimal parameter for extracting flavonoids were conformed by analysis of response surface method as follows:the extracting reagent is 70%methanol，the ratio of solid to liquid is 1∶40，the extracting time was 4 h，the extracting temperature is 70℃.Flavonoids were measured respectively from the callus induced for 100 d on 30 kinds of different concentration and combination of plant growth regulators.The results showed that the best culture medium was MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)，flavonoids contain in callus on the medium for 100 d reached 73.90 mg/g.accumulative dynamic state of flavonoids in callus cultured for 30 d were measured continuously，the optimal time of extracting flavonoids was determined.Flavonoids content in callus of A.venetum were increased with tissue culture technology through optimizing extraction process and screening concentration and combination of plant growth regulators.

Apocynum venetum L.;flavonoids;callus;extraction process;plant growth regulator

1001-6880(2011)05-0882-07

2009-12-28 接受日期:2010-04-27

国家自然科学基金项目(亚麻与罗布麻体细胞杂交及其种质的耐盐性遗传研究30660095);新疆教育厅重点科研项目(亚麻与罗布麻体细胞杂交育种研究XJEDU2006108)

*通讯作者 Tel:86-013669900154;E-mail:wji1118@yahoo.com.cn

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