海绵共附生疣孢菌FIM06031细胞毒活性代谢产物的研究

聂毅磊，王传喜，郑永标，林 如，许丽艳，彭 飞，方东升，连云阳，江 红*

1福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福州350007; 2福建师范大学生命科学院，福州350108;3汕头大学医学院，汕头515041

海绵共附生疣孢菌FIM06031细胞毒活性代谢产物的研究

聂毅磊1，王传喜1，郑永标2，林 如1，许丽艳3，彭 飞1，方东升1，连云阳1，江 红1*

1福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福州350007;2福建师范大学生命科学院，福州350108;3汕头大学医学院，汕头515041

利用正相硅胶、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和反相C18柱层析等方法，从海绵共附生疣孢菌FIM06031的发酵菌丝体提取液中分离到三个化合物(1～3)。通过波谱方法鉴定其中一个化合物harrucomicin C(1)为新倍半萜，另外两个已知化合物为cyperusol C(2)和Nb-乙酰色胺(3)。活性研究表明harrucomicin C对肿瘤细胞株HepG2、EC109和HeLa具显著增殖抑制活性，其IC50值分别为16.99、25.33 μM和34.64 μM;cyperusol C对肿瘤细胞HeLa和HepG2增殖抑制作用的IC50值分别为149.99 μM和167.78 μM。

疣孢菌;细胞毒活性;Harrucomicin C;倍半萜;Cyperusol C

长期以来链霉菌是筛选抗肿瘤药物的主要来源菌［1-3］，但随着大多数链霉菌菌株被反复研究，从中发现新药物的机率在逐渐降低，因而，人们把开发新菌源作为寻找新抗肿瘤药物的重要突破口。海洋环境特殊，海洋放线菌产生的抗生素具有结构多样及活性独特的特点［4-6］。

疣孢菌(Verrucosispora)属于放线菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae)。目前分离到的该属菌种较少，对疣孢菌次生代谢产物的研究报道更少，已报道的该属三个菌株分别产生结构新颖的抗菌化合物abyssomicin C［7］、抗肿瘤化合物proximicins A-C［8］和雄激素拮抗剂gifhornenolones A-B［9］。

我们采取选择性分离方法从福建莆田平海海域的海绵中，分离到几十株放线菌，基于16S rRNA基因序列的分子分类鉴别这些菌株属于疣孢菌属，选取其中一株初筛具显著抑制肿瘤细胞作用的疣孢菌FIM06031为研究对象，研究其肿瘤细胞毒活性代谢产物。从FIM06031的发酵菌丝体提取液中分离得到三个化合物(1～3)，包括一个新倍半萜harrucomicin C(1)，其对肿瘤细胞株HepG2，EC109和HeLa具显著增殖抑制活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器材料

Beckman J-20xp离心机;硅胶GF254薄层层析板(青岛海洋化工厂);柱层析用硅胶(100～200目);凝胶Sephadex LH-20(Phammacia);反相硅胶RP-18 (Merck);API QSTAR Pulsar i System质谱仪;Bruker AV-400超导核磁共振波谱仪(TMS作为内标，δ为ppm，J为Hz);所用试剂均为分析纯。

1.1.2 实验菌株和细胞株

疣孢菌FIM06031，福建省微生物研究所菌种资源库保存，作为专利菌种保藏于中国微生物菌种保藏中心，编号:CGMCC NO.3924。

实验细胞株HepG2(肝癌细胞)、EC109(食管癌细胞)和HeLa(宫颈癌细胞)由汕头大学医学院提供，均为国际通用的肿瘤细胞株。

1.1.3 种子培养基

种子培养基(%):可溶性淀粉1.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，MgSO4·7H2O 0.05，NaCl 0.05，(NH4)2SO40.05，CaCO30.1，自来水配制，pH 7.8(灭菌前)。

1.1.4 发酵培养基

发酵培养基(%):可溶性淀粉4.0，葡萄糖0.5，黄豆饼粉 2.5，酵母粉 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.05，CaCO30.1，50%陈海水配制，pH 7.8(灭菌前)。

1.2 方法

1.2.1 菌株FIM06031的发酵

取一铂环菌株FIM06031淀粉天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养基，35℃，240 rpm/min培养45 h;10%移种量转入30 L发酵培养基，28℃，240 rpm/min振荡培养96～120 h。

1.2.2 成分的提取

FIM06031菌株发酵液(30 L)4500 rpm/min离心15 min后获得的菌丝体用95%乙醇(10 L)浸泡1 d，浸泡液减压浓缩去除乙醇。浓缩液用乙酸乙酯(6 L)萃取，减压浓缩得膏状提取物(13.5 g)。

1.2.3 化合物的分离和纯化

膏状提取物(13.5 g)行正相硅胶柱层析，洗脱剂采用环己烷∶丙酮=2∶1，分段收集洗脱液。硅胶薄层层析(TLC)(二氯甲烷∶甲醇=5∶1)检测，硫酸-乙醇(5∶95)显色，105℃烘烤，合并相同组份，得到组份A(2.9 g)和组份B(2.5 g);组份A行反相C18色谱柱层析(甲醇∶水=50∶100)，分段收集洗脱液，合并相同组份，得到组份A1(0.7 g);A1经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱，合并得到组份A11(0.4 g);A11经正相硅胶柱层析，洗脱剂采用石油醚∶丙酮=1∶1，分段收集洗脱液，TLC检测，在Rf值约0.6左右处有粉红色转黑色斑点，合并获得化合物1(3 mg)，在Rf值约0.4左右处有粉红色转黑色斑点，合并获得化合物2(4 mg);组份B(2.5 g)经反相C18色谱柱层析(甲醇∶水=75∶100)，分段收集洗脱液，合并得到组份B1(0.6 g);B1行正相硅胶柱层析，洗脱剂采用石油醚∶丙酮=3∶1，分段收集洗脱液，TLC检测，在Rf值约0.7左右处有黄色斑点，合并获得化合物3(8 mg)。

1.2.4 MTT法［10］测定化合物细胞毒活性

分别取对数生长期的HepG2(肝癌细胞)、EC109(食管癌细胞)和HeLa(宫颈癌细胞)，调整细胞浓度至1×105～4×105个/mL，取100 μL接种于96孔板，于37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，将培养孔内的培养基吸净，每孔加入100 μL相应浓度的含药物的培养液，每一样品设三平行组，同时设空白，阳性对照为氟尿嘧啶(5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)，于培养箱继续培养72 h后，加入MTT液(5 mg/mL)10 μL，继续孵育3～4 h，吸净培养液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪(λ=570 nm)上测定各孔的光吸收值。

2 结果与讨论

2.1 化合物结构鉴定

通过正相硅胶、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和反相C18柱层析，共分离到3个化合物，根据NMR以及MS数据分别鉴定为harrucomicin C(1)、cyperusol C(2)和Nb-乙酰色胺(3)。化学结构式见图1:

图1 化合物1～3的结构Fig.1 Structures of compounds 1-3

化合物1 白色无定形粉末。溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯等有机溶剂。［α］23D+14.2(c 0.2，MeOH);HR-ESI-MS m/z:379.2249［M+Na］+(calcd for 379.2351)，确定分子式为C23H32O3，计算其不饱和度为8。1H NMR(CD3OD，400 MHz)，在低场区显示有5个芳环质子信号δ:7.27(5H，m)，同时碳谱中6个信号δ:135.9(s)，130.4(d，×2)，129.5(d，×2)，128.1(d)，进一步证实了单取代苯环的存在。比较化合物1和已知化合物cyperusol C (2)的1H及13C NMR数据发现，1除多出一个单取代的苯环信号外，在氢谱上多了一个亚甲基氢信号δ 3.61(2H，s)，在碳谱上多了两个碳信号δ 173.3和δ 42.6。分析HSQC图谱，发现δ 3.61(2H，s)与δ 42.6相关，HMBC图谱中δ 3.61(2H，s，H-2')质子信号与δ 173.3(C-1')、δ 135.9(C-3')和δ 130.4 (C-4')碳信号相关，结合分子式推测1可能比2多了一个苯乙酰基。比较两个化合物的氢谱，发现1中H-1位质子信号(δ 4.51)与化合物2(δ 3.23，H-1)的化学位移相差较大，推测苯乙酰基可能连在C-1位羟基上。HMBC图谱中δ 4.51(H-1)与δ 173.3 (C-1')的相关，进一步证实了这一推断，化合物1的平面结构由此确定。

1的相对构型通过ROESY图谱确定，在ROESY图谱中可以看到信号H-1与Hα-3、H-5相关，H-5与H-7相关，H-14与H-15相关。与文献［11］报道的核磁数据对比进一步验证了化合物1的相对构型(见图1)。经SciFinder和INSPEC等数据库检索，未发现相关报道，表明这是一个新的化合物，命名为harrucomicin C。主要二维相关见图2。并对其核磁数据进行了归属。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ: 4.51(1H，dd，J=10.4，4.8 Hz，H-1)，1.68(1H，m，Hα-2)，1.62(1H，m，Hβ-2)，1.75(1H，ddd，J= 12.0，3.5，3.0，Hz，Hβ-3)，1.57(1H，ddd，J=13.5，12.0，3.5 Hz，Hα-3)，1.36(1H，m，H-5)，1.86(1H，m，Hα-6)，1.22(1H，m，Hβ-6)，1.88(1H，m，H-7)，1.45(1H，m，Hα-8)，1.30(1H，dddd，J=17.0，13.5，13.0，3.5 Hz，Hβ-8)，1.43(1H，ddd，J=13.5，3.5，3.5 Hz，Hβ-9)，1.04(1H，ddd，J=13.5，13.0，4.0 Hz，Hα-9)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-12)，1.71 (3H，s，H-13)，0.90(3H，s，H-14)，1.08(3H，s，H-15)，3.61(2H，s，H-2')，7.27(5H，m，H-3'-8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:82.9(d，C-1)，26.1(t，C-2)，41.3(t，C-3)，72.0(s，C-4)，54.2(d，C-5)， 26.8(t，C-6)，47.2(d，C-7)，27.5(t，C-8)，41.6 (t，C-9)，39.5(s，C-10)，151.6(s，C-11)，108.9 (t，C-12)，21.1(q，C-13)，14.5(q，C-14)，22.5 (q，C-15)，173.3(s，C-1')，42.6(t，C-2')，135.9 (s，C-3')，130.4(d，C-4')，129.5(d，C-5')，128.1 (d，C-6')，129.5(d，C-7')，130.4(d，C-8')。

图2 Harrucomicin C的主要1H-1H COSY，HMBC和ROESY相关Fig.2 Key1H-1H COSY，HMBC and ROESY correlations for Harrucomicin C

化合物2 无色油状物。溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯等有机溶剂。［α–31.5(c 1.0，MeOH) APCI-MS(大气压化学电离质谱)m/z:238.5［M］+。HR-EI-MS m/z:238.1934［M］+(calcd for 238.1933)确定分子式为 C15H26O2。1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:3.23(1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H-1)，1.64(2H，m，H-2)，1.72(1H，ddd，J= 12.0，3.5，3.0 Hz，Hβ-3)，1.52(1H，ddd，J=13.5，12.0，3.5 Hz，Hα-3)，1.28(1H，m，H-5)，1.86(1H，m，Hα-6)，1.24(1H，m，Hβ-6)，1.90(1H，m，H-7)，1.56(1H，m，Hα-8)，1.38(1H，dddd，J=17.0，13.5，13.0，3.5 Hz，Hβ-8)，1.94(1H，ddd，J=13.5，3.5，3.5 Hz，Hβ-9)，1.13(1H，ddd，J=13.5，13.0，4.0 Hz，Hα-9)，4.69(2H，m，H-12)，1.74(3H，s，H-13)，0.88(3H，s，H-14)，1.08(3H，s，H-15);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:80.3(d，C-1)，29.4(t，C-2)，41.9(t，C-3)，72.4(s，C-4)，54.1(d，C-5)，27.1(t，C-6)，47.5(d，C-7)，27.8(t，C-8)，42.0 (t，C-9)，40.3(s，C-10)，151.8(s，C-11)，108.9 (t，C-12)，21.2(q，C-13)，13.8(q，C-14)，22.6 (q，C-15)。化合物2的相对构型通过ROESY图谱确定，在ROESY图谱中可以看到信号H-1与H-3、H-5相关，H-5与H-7相关，H-14与H-15相关。通过与文献［11］报道的核磁数据对比进一步验证了化合物2为cyperusol C。

化合物3 淡黄色油状物。UV λmax(MeOH) nm:218，280。ESI-MS m/z:203［M+H］+，225［M +Na］+结合氢谱和碳谱确定分子式为 C12H14N2O。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.14(1H，brs，NH-1)，7.04(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，7.60(1H，d，J=8.0 Hz，H-4)，7.13(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-5)，7.21(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-6)，7.38(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，2.98(2H，t，J=6.5 Hz，H-10)，3.60(2H，dt，J=6.5，6.0 Hz，H-11)，5.53(1H，brs，NH-12)，1.92(3H，s，H-14);13CNMR (CD3OD，100 MHz)δ:122.3(d，C-2)，113.3(s，C-3)，119.2(d，C-4)，119.6(d，C-5)，123.3(d，C-6)，112.2(d，C-7)，138.2(s，C-8)，128.8(s，C-9)，26.2(t，C-10)，41.5(t，C-11)，173.2(s，C-13)，22.6(q，C-14)。与文献［12］报道的核磁数据对比进一步确定了化合物3为Nb-乙酰色胺。

2.2 细胞毒活性

Harrucomicin C(1)对肿瘤细胞HepG2，EC109和HeLa具有显著增殖抑制活性，其IC50值分别为16.99 μM、25.33 μM和34.64 μM;cyperusol C(2)对肿瘤细胞HeLa和HepG2也具增殖抑制活性，其IC50值分别为149.99 μM和167.78 μM。

2.3 讨论

从海绵共附生疣孢菌FIM06031的发酵菌丝体提取液中分离到三个代谢产物harrucomicin C，cyperusol C和Nb-乙酰色胺。其中harrucomicin C为新的具有显著肿瘤细胞增值抑制活性的倍半萜，对其作用机理值得进一步的研究，同时预示疣孢菌是产生新生物活性次生代谢产物的重要菌株来源，值得进一步的研究。由于疣孢菌FIM06031的发酵菌丝体中harrucomicin C含量微量，样品制备困难，发酵条件值得进一步优化。Cyperusol C是2004年Xu FM等［11］首次从中药Cyperus longus中分离到，2010年Shirai M等［9］从一株疣孢菌中也分离到该化合物;Nb-乙酰色胺是2003年Li Y等［12］从海绵共附生的真菌中分离到。

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Novel Secondary Metabolites with Cytotoxic Activities Produced by Verrucosispora sp.FIM06031 from Marine Sponge

NIE Yi-lei1，WANG Chuan-xi1，ZHENG Yong-biao2，LIN Ru1，XU Li-yan3，PENG Fei1，FANG Dong-sheng1，LIAN Yun-yang1，JIANG Hong1*1Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，Fujian institute of microbiology，Fuzhou 350007，china;2Life sciences College of Fujian Normal Univesity，Fuzhou 350108，china;3Shantou University Medical College，Shantou 515041，china

Three compounds(1-3)were isolated from culture broth of Verrucosispora sp.FIM06031 from marine sponge by silica gel，sephadex LH-20 and C18reversed phase column chromatography.On the basis of spectral data，they were identified as a novel sesquiterpenoid harrucomicin C(1)，cyperusol C(2)，and Nb-acetyltryptamine(3).Compound 1 showed prominent growth inhibitory activity against the tumor cell lines HepG2，EC109 and HeLa with IC50values of 16.99，25.33 μM and 34.64 μM，respectivity in vitro by MTT assay，while 2 showed growth inhibitory activity against HeLa and HepG2 cells with IC50values of 149.99 μM and 167.78 μM，respectively.

Verrucosispora;cytotoxic activity;harrucomicin C;sesquiterpenoid;cyperusol C

1001-6880(2011)05-0797-04

2011-04-20 接受日期:2011-07-29

国家“十一五”重大专项(2010ZX09401-403);福建省自然科学基金项目(2011J01092);福建省重点项目(2009R10003-1)

*通讯作者 Tel:86-591-83475544;E-mail:jianghong709@yahoo.com.cn

R284.2

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