三氯醋酸-丙酮沉淀法用于骨组织蛋白的提取

崔永锋，杨 贞，朱宝华，肖鲁伟，童培建

1杭州市萧山区第一人民医院骨科，杭州 3112002浙江中医药大学 骨伤科研究所，杭州 310053

·论著·

三氯醋酸-丙酮沉淀法用于骨组织蛋白的提取

崔永锋1，杨 贞2，朱宝华1，肖鲁伟2，童培建2

1杭州市萧山区第一人民医院骨科，杭州 311200
2浙江中医药大学 骨伤科研究所，杭州 310053

目的探讨三氯醋酸-丙酮沉淀法提取骨组织蛋白的可行性和效率。方法采用盐酸脱钙法和三氯醋酸-丙酮沉淀法，分别用于骨组织蛋白的提取，并对两种方法的提取效率进行对比。结果三氯醋酸-丙酮沉淀法可获得较高的骨蛋白提取率，与盐酸脱钙法相比，分子条带分布范围相近，且不受骨髓造血组织影响。结论三氯醋酸-丙酮沉淀法可以用于骨组织蛋白质组的研究。

三氯醋酸-丙酮沉淀法；骨组织；蛋白提取

骨组织中含有大量蛋白质分子，包括各种细胞因子，是细胞增殖、分化、基质合成和调控的重要信息物质，在各种骨骼疾病中发挥决定性的作用。由于骨组织的特殊性，直接从骨组织中提取蛋白有较大难度，这阻碍了骨骼疾病蛋白质组的研究。建立高效的骨蛋白提取技术是研究骨组织蛋白质组的技术关键。本研究建立了适宜的骨蛋白提取技术，并通过多种提取方法的对比，发现三氯醋酸(trichloroacetic acid， TCA)-丙酮沉淀法可获得较高的骨蛋白提取率，且不受高丰度蛋白的影响，适合用于蛋白质组的研究。现对TCA-丙酮沉淀法进行介绍，并将其与盐酸脱钙法[1]的提取效率进行对比。

材料和方法

实验动物采用健康雄性清洁级Wistar大鼠(中国科学院上海斯莱克实验动物中心)，3月龄，体重(200±20)g，在水合氯醛麻醉下，断头放血处死，在4℃预冷的75%医用酒精中浸泡约20 min，在无菌条件下，取出股骨，剔除一切软组织，液氮冷冻保存。

主要配制溶液(均为进口分析纯) 丙酮溶液Ⅰ：丙酮-20℃预冷(含w/v 10%三氯醋酸，v/v 0.07% β-巯基乙醇)；丙酮溶液Ⅱ：丙酮-20℃预冷(含v/v 0.07% β-巯基乙醇)；裂解液：8 mol/L 尿素、4% 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、30 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，使用前再加入1 mol/L二硫苏糖醇65 μl/ml和1 mmol/L苯甲基磺酰氟。

仪器与设备EttanTM IPGPhor等电聚焦仪、Mini- phor垂直电泳系统、UMAX ImageScanner凝胶扫描仪、3300 proUV/VIS型紫外可见分光光度仪、双向电泳图像分析软件ImageMaster 2D 6.0、2-D Quant Kit蛋白定量试剂盒均购自Amersham BioSciences公司。

TCA-丙酮沉淀法操作步骤(1)从液氮中取出股骨，用剪刀剪成1 mm2以下的小颗粒，冰水洗涤以清除骨髓造血组织，在预冷的研钵用液氮研磨20 min成粉，转入5 ml离心管。(2)加入5倍体积的预冷丙酮溶液Ⅰ，边振荡边逐滴加入，-20℃静置，每隔20 min振荡1次，每次约3 min，共4次，然后置于-20℃过夜。在4℃，×12 000 g，高速离心10 min，弃去上清液。(3)加入5倍体积的预冷丙酮溶液Ⅱ，操作同第(2)步，置于-20℃过夜。在4℃，×12 000 g，高速离心10 min，弃去上清液。0℃冰水中放置1h以挥发去除丙酮成干粉，-20℃保存。(4)每40毫克干粉加入800 μl裂解液，置于-20℃，每隔20 min振荡1次，共3次，4℃冰箱过夜。在4℃，×12 000 g，高速离心20 min，吸取上清液，作为样品1；剩余物再加入1 ml裂解液，4℃裂解过夜，如上法获得样品2；两液分装保存，以备分别测定浓度和电泳用。

盐酸脱钙法操作步骤参考文献[1]并进行改良，具体步骤如下：(1)将股骨研磨成粉放入1.2 mol/L盐酸中，4℃脱钙过夜(每0.2 g骨组织加1 ml盐酸)，离心，吸取上清液作为提取液1；(2)沉淀物水洗后，每40毫克干粉加入800 μl裂解液，在4℃孵育72 h，离心后取上清液作为提取液2；(3)沉淀物加入包含0.5 mol/L EDTA-Na4的上述裂解液中，在4℃孵育72 h，离心后取上清液作为提取液3；(4)剩余物在6 mol/L盐酸、4℃下孵育过夜，离心后，取上清液作为提取液4；(5)把提取物1～4，分别用丙酮在-20℃过夜以沉淀蛋白，在4℃，×12 000 g高速离心10 min，弃上清，获得沉淀蛋白，加入裂解液过夜；(6)在4℃，×12 000 g高速离心20 min，吸取上清液，分装保存，以备分别测定浓度和电泳用。

观察指标(1)对样品提取前的干燥骨组织测重：由于盐酸脱钙法提取液4中多为高丰度蛋白，影响其他的蛋白鉴定，因此弃去提取液4。(2)在获得提取液1、2、3后，分别丙酮沉淀，再加入裂解液4℃过液，获得蛋白样品1、2、3。TCA-丙酮沉淀法所获得为蛋白样品1、2。(3)蛋白浓度测定按照2-D Quant Kit蛋白定量试剂盒说明书进行。采用紫外可见分光光度仪，测定吸光度，制作拟合曲线后，推算出蛋白质样品的浓度。(4)对两种方法所提取蛋白，各取出适量，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析。

结 果

蛋白质浓度测定结果盐酸脱钙法与TCA-丙酮沉淀法提取骨蛋白具有相近的提取率，分别为8.25‰和7.82‰。仅从提取的骨量看，TCA-丙酮沉淀法可获得较高的骨蛋白提取率(表1)。

SDS-PAGE凝胶电泳结果采用SDS-PAGE凝胶电泳对两者进行比较验证显示，各个通道中蛋白条带无论宽窄均清晰、无拖尾现象。其中TCA-丙酮沉淀法条带分布均匀，条带间隙清晰，条带数明显多于盐酸脱钙法；后者可能因样品混合后沉淀形成，导致蛋白浓度降低，条带颜色稍淡。泳道4～6每一条带在泳道1～3的对应位置均有相同条带出现，箭头所示条带比1～3宽且颜色深；泳道7、8为血清蛋白对照，在1～6相同位置未见明显的聚集(图1)。

表 1 两种提取方法所得蛋白样品浓度对比

1～3. 三氯醋酸-丙酮沉淀法样品1、2等量混合后所获得蛋白的电泳图(同一提取物的3个重复)；4～6. 盐酸脱钙法样品1、2、3等量混合后所获得蛋白的电泳图(同一提取物的3个重复)；7、8. 血清蛋白的2个重复作为对照；箭头所示条带比1～3宽且颜色深1-3. the results of extractions 1 and 2 mixture by trichloroacetic acid-acetone precipitation method(three repeats of the same sample); 4-6. the results of extractions 1 and 2 and 3 mixture by hydrochloric acid decalcification method(three repeats of the same sample); 7,8. control group with 2 repeats of serum albumin；the band with arrow was wider and had deeper color than band 1 to 3

讨 论

骨蛋白提取技术是骨蛋白质组研究的一个瓶颈，如何获取最大的提取率、提全率和减少高丰度蛋白的影响是极需要解决的课题。由于骨组织硬度大，骨基质中羟基磷灰石、高丰度的胶原和蛋白多糖含量高，而重要的非胶原性蛋白如各种生长因子、细胞因子和骨特异性蛋白等含量低，难以从骨组织中提出。传统方法是把骨组织研磨成粉末，再用裂解液孵育。然而机械粉碎的方法很费力，特别是大的动物骨。更重要的是未脱钙骨研磨后在裂解缓冲液中很易提取到大量胶原、蛋白多糖和大量金属离子，影响等电点沉积，并影响对其他低丰度蛋白的全面检测。

Jiang等[1]比较了盐酸脱钙法、单纯裂解法和研磨后裂解法3种提取骨蛋白，结果骨蛋白提取率分别为8.25‰、0.73‰和3.31‰，盐酸脱钙后骨蛋白提取率为显著提高；采用盐酸脱钙法通过自动2D-LC-MS/MS分析仪可以提取6202种单肽，约对应2479种蛋白单体，有助于骨蛋白质组的全面分析；但该技术步骤复杂，需要分为4步提取骨蛋白，且各组分之间因酸碱度不同难以进行混合，如采用双向电泳进行差异蛋白质组的研究，就大大增加了费用和工作量，且酸浸泡使蛋白分解为多肽，不利于双向电泳后的质谱鉴定。王簕等[2]采用单纯研磨法、单纯锤击法和锤击研磨法分别对免骨组织蛋白进行提取，发现锤击研磨法可获取较高骨蛋白提取率，但需要特殊的锤式组织粉碎器。

TCA-丙酮沉淀法主要用于植物组织的蛋白提取。本研究首次将TCA-丙酮沉淀法用于骨蛋白的提取，结果表明该法可获得7.82‰的蛋白提取率，与盐酸脱钙法有相近的提取率。从SDS-PAGE电泳图看，泳道4～6每一条带在泳道1～3的对应位置均有相同条带出现，表明TCA-丙酮沉淀法与盐酸脱钙法提取蛋白的相对分子质量分布基本一致。泳道4～6中仅箭头所示条带比1～3宽且颜色深，表明盐酸脱钙提取法仅在此相对分子质量对TCA-丙酮沉淀法有补充作用。泳道7、8为血清蛋白对照，在1～6相同位置未见明显的聚集，表明所提蛋白未受到骨髓中造血组织污染(图1)。因此认为TCA-丙酮沉淀法可以用于双向电泳中骨蛋白的提取，比较适合于骨组织蛋白质组的研究。

在骨蛋白提取技术方面，尚需要进一步的探索，如改进裂解液的成份、增加裂解时间和震荡次数、减小骨颗粒大小等。分步提取骨蛋白可对不同性质的蛋白质分别提取，但也需对不同性质的蛋白分别进行研究，这需要根据研究者的目的进行选择。

[1] Jiang XG, Ye ML, Jiang XN, et al. Method development of efficient protein extraction in bone tissue for proteome analysis[J]. J Proteome Res, 2007, 6(6):2287-2294.

[2] 王簕，裴国献. 兔骨组织总蛋白的提取和在免疫印迹法中的应用[J]. 生命科学研究，2009，13(2)：137-141.

ApplicationofTrichloroaceticAcid-AcetonePrecipitationMethodforProteinExtractioninBoneTissue

CUI Yong-feng1, YANG Zhen2, ZHU Bao-hua1, XIAO Lu-wei2, TONG Pei-jian2

1Department of Orthopedics, the First People’s Hospital of Xiaoshan District, Hangzhou 311200, China
2Institute of Orthopedics, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China

CUI Yong-feng Tel:0571-83807651， E-mail: guke120@hotmail.com

ObjectiveTo explore the feasibility and efficiency of extracting protein from bone tissue using trichloroacetic acid (TCA)-acetone precipitation method.MethodsHydrochloric acid (HCL) decalcification method and TCA-acetone precipitation method were separately used for bone protein extraction. The efficiencies of these two methods were compared.ResultsTCA-acetone precipitation method had significantly higher extraction efficiency. Compared with HCL decalcification method, it had less pollution from bone marrow hematopoietic tissue. Protein band distribution was similar between these two methods.ConclusionTCA-acetone precipitation method is useful for bone proteomics research.

trichloroacetic acid-acetone precipitation method; bone tissue; protein extraction

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：210-213

崔永锋 电话：0571-83807651, 电子邮件: guke120@hotmail.com

Q-34

A

1000-503X(2011)02-0210-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.022

中国博士后科学基金(20080431334)Supported by the China Postdoctoral Science Foundation(20080431334)

2010-07-02)