腺相关病毒介导β淀粉样肽单链抗体对动物阿尔茨海默病的治疗效果

蔡 炯，牛 娜，李 方，王世真

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院核医学科，北京 100730

·论著·

腺相关病毒介导β淀粉样肽单链抗体对动物阿尔茨海默病的治疗效果

蔡 炯，牛 娜，李 方，王世真

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院核医学科，北京 100730

目的观察携带β淀粉样肽单链抗体基因的腺相关病毒对阿尔茨海默病动物模型的治疗效果。方法给突变淀粉样蛋白前体转基因阿尔茨海默病模型小鼠腿部肌肉注射携带Aβ单链抗体基因的腺相关病毒，在药物注射前和注射后3、7、10个月用Morris水迷宫测定潜伏期，并在药物注射后10个月取大脑做组织切片，行免疫组织化学染色，观察淀粉样斑块在海马的沉积。结果注射基因治疗药物后3个月，阿尔茨海默病模型小鼠的学习和记忆能力明显改善，注射基因治疗药物后10个月，模型小鼠海马淀粉样斑块的沉积减少。结论肌肉注射携带Aβ单链抗体基因的腺相关病毒对阿尔茨海默病模型有治疗作用。

阿尔茨海默病;腺相关病毒;β淀粉样肽;单链抗体

β淀粉样肽(amyloid β peptide, Aβ)在大脑组织的过载是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)发病的主要原因[1]，动物实验表明针对Aβ的主动免疫或被动免疫都可以清除AD动物大脑组织内过量的Aβ[2-3]。但临床研究显示，Aβ的免疫接种极有可能引起脑脊膜炎，这种副作用可能和T细胞或抗体恒定区介导的免疫反应有关[4-6]。有研究从人类单链抗体噬菌体文库中筛选出了Aβ的单链抗体基因并制备了携带该基因的重组腺相关病毒[7-11]。本研究利用较为成熟的突变淀粉样蛋白前体(mutant amyloid precursor protein,APP)转基因动物模型测试该基因药物对AD的治疗效果。

材料和方法

材料重组腺相关病毒rAAV2/1-Abeta-scFv为本实验室研制。APP转基因AD模型小鼠从中国医学科学院实验动物研究所引进。引物由北京擎科生物技术有限公司合成，序列为P1:GTCACCCCTAGTTCTTTTT; P2:GGTAGACTTCTTGGCAATAC; R1:CC- GATGATGACGAGGACGAT； R2：TGAACACGTGACG- AGGCCGA。蛋白酶K购自北京欣经科生物技术有限公司。

转基因和对照背景小鼠的PCR鉴定基因型鉴定时先剪取0.5～1 cm鼠尾置于微量离心管，加入0.5 ml鼠尾裂解液(100 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、0.2% SDS、 pH 8.0)，再加入20 mg/ml 蛋白酶K 2.5 μl至终浓度100 μg/ml, 50℃振摇过夜。次日，离心，弃蛋白酶消化所剩的残渣。在上清液中加入0.5 ml异丙醇颠倒混匀，待DNA析出后，离心弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干沉淀。沉淀溶于200 μl Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)，65℃保温1 h后将DNA完全溶解，-80℃冻存。随后分别取提取物0.5 μl加入到PCR体系中，94℃变性、58℃退火、72℃延伸。扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳。

动物分组与Morris水迷宫测试将转基因AD模型小鼠24只按雌雄随机分成两组: APP(+)AAV1-scFv基因治疗组和APP(+)AAV1-增强绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)对照治疗组，每组12只，雌雄各半。APP(-)正常对照组(与转基因AD模型小鼠遗传背景相同的小鼠，年龄相同)12只，雌雄各半。动物10月龄时，用Morris水迷宫测试动物的潜伏期，测试时间持续2.5 d，分别在前两天的上午和下午、第3天上午的同一时间进行。水池直径80 cm，平台低于水面1.5 cm，加入奶粉溶于水中隐蔽平台，水温控制在(25±1)℃。

基因药物注射与Morris水迷宫测试第1次水迷宫测试完毕后第2天对基因治疗组小鼠和对照治疗组小鼠分别注射4×1010拷贝AAV1-scFv(溶于100 μl PBS，肌肉注射)和4×1010拷贝AAV1-EGFP(溶于100 μl PBS，肌肉注射)。APP(-)正常对照组小鼠注射100 μl PBS，所有注射部位均为右股四头肌。分别于注射药物后3、7、10 个月，动物达到13、17、20个月龄时，用Morris水迷宫测试动物的潜伏期。

EGFP和scFv表达的组织学观察注射基因药物后10个月，用10%水合氯醛过量麻醉动物，灌流固定后取动物的肌肉组织进行冰冻切片，直接在荧光显微镜下观察，或进行免疫组织化学染色后观察。

老年斑的检测注射基因药物后10个月，用10%水合氯醛过量麻醉动物，灌流固定后取动物的脑组织进行冰冻切片，进行免疫组织化学染色后观察基因治疗对大脑海马老年斑沉积的影响。选用6E10单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶羊抗小鼠抗体为二抗，DAB显色。

统计学处理行为学测试数据统计用SPSS 10.0软件，组间采用ANOVA分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

PCR鉴定结果PCR结果显示24只入选的AD模型小鼠带有APP基因(1～12号和19～30号)，经引物R1、R2进行PCR扩增，得到PCR产物大小574 bp(图1A)；经引物P1、P2进行PCR扩增，得到PCR产物大小692 bp(图1B)；而正常对照组的12只动物无APP基因(13～18号，31～36号)。

Morris水迷宫测试结果水迷宫实验显示10月龄转基因APP(+) AD模型小鼠和APP(-) 同背景正常动物相比，其第1次寻找隐匿平台所用时间显著延长，动物的学习能力降低，但第2～5次寻找隐匿平台所用时间差异无统计学意义，动物的记忆能力无变化。给药3个月后，APP(+)AAV1-scFv基因治疗组小鼠的学习和记忆能力接近APP (-)同背景正常对照组小鼠，而和APP(+)AAV1-EGFP对照治疗组小鼠相比，其第1次寻找隐匿平台所用时间显著缩短，动物的学习能力改善[(57±30)s 比(89±35)s,P<0.05]；第5次寻找隐匿平台所用时间显著缩短，动物的记忆能力得以改善[(31±19)s 比(63±30)s,P<0.05]。给药7个月后，APP(+)AAV1-scFv基因治疗组小鼠的记忆能力和APP(+)AAV1-EGFP对照治疗组小鼠相比，第5次寻找隐匿平台所用时间显著缩短[(34±12)s 比(47±15)s,P<0.05]。给药10个月后，APP(+)AAV1-scFv基因治疗组小鼠的记忆能力和APP(+)AAV1-EGFP对照治疗组小鼠、APP(-)正常对照组小鼠间差异无统计学意义。APP(+)AAV1-EGFP对照治疗组小鼠第4和5次寻找隐匿平台所用时间比APP(-)正常对照组小鼠显著延长[(43±20)s 比(28±14)s,P<0.05；(42±16)s比(27±9)s,P<0.05](表1)。

M：DL2000；1～12：APP(+)转基因动物；13：APP(-)同遗传背景正常动物M ：DL2000；1-12：APP(+) transgenic mice；13：APP(-) normal mice with same genetic backgroundA.引物为R1、R2的PCR结果；B.引物为P1、P2的PCR结果， A. PCR products with primers R1 and R2；B. PCR products with primers P1 and P2

EGFP和scFv的表达治疗10个月后，EGFP基因主要在注射部位右股四头肌表达，而在左股四头肌很少表达，而注射rAAV/抗β淀粉样肽单链抗体基因的基因治疗组无EGFP的表达(图2)。用单链抗体的c-myc小鼠单克隆抗体对肌肉样本进行免疫组织化学染色，结果显示APP(+)AAV1-scFv基因治疗组治疗10个月后右股四头肌的抗β淀粉样肽单链抗体表达，左股四头肌很少表达，而APP(+)AAV1-EGFP对照治疗组无表达(图3)。

表 1 基因治疗各个时间点的小鼠Morris水迷宫测试出的潜伏期

APP：突变淀粉样蛋白前体；EGFP：增强绿色荧光蛋白 ；APP(-)：正常对照组；APP(+)AAV1-EGFP：对照治疗组；APP(+)AAV1-scFv：基因治疗组；和同一时间点APP(-)相比，aP<0.05；和同一时间点APP(+)AAV1-EGFP相比，bP<0.05

APP：mutant amyloid precursor protein；EGFP：enhanced green fluorescent protein；APP(-)：normal control group; APP(+)AAV1-EGFP: control gene therapy group; APP(+)AAV1-scFv: gene therapy group；aP<0.05 compared with PBS-treated APP(-) mice at the same time point;bP<0.05 compared with APP(+)AAV1-EGFP mice at the same time point

老年斑的检测结果注射rAAV/抗β淀粉样肽单链抗体基因治疗AD 10个月后，淀粉样斑块减少，而对照治疗组斑块沉积较多(图4)。

讨 论

单链抗体是利用基因工程的手段将抗体的重链可变区和轻链可变区通过一段柔性多肽相连接，保持了抗体结合抗原的特性而缩小了抗体的大小和分子质量，一般只有全长抗体的1/6大小。通过噬菌体展示和抗原筛选的方法将抗体的功能和基因有机地融合为一体[12]。AD和Aβ过载密切相关，国内从人类单链抗体噬菌体文库中筛选出了Aβ的单链抗体基因，早于国外的研究[7-11]。本研究将携带有4×1010拷贝抗人Aβ单链抗体基因的1型血清腺相关病毒注射到AD转基因模型小鼠的肌肉内，3个月后，基因治疗组小鼠的学习和记忆能力接近正常。给药7个月后，基因治疗组小鼠和对照治疗组[APP(+)AAV1-EGFP]相比，虽然第5次寻找隐匿平台所用时间显著缩短，但治疗药物的效果已经不如前期，可能由于治疗基因是来源于人的，产生的人单链抗体引起了小鼠的抗抗体反应，从而改变了药物的治疗效果。给药10个月后，基因治疗组小鼠的学习记忆能力和治疗对照差异无统计学意义，表明基因治疗的保护作用已经不再明显。此时基因治疗组小鼠脑内淀粉样沉积少于治疗对照，表明淀粉样沉积和学习记忆能力可能不是直接相关。有研究表明，和学习记忆能力直接相关的是Aβ寡聚体，而不是淀粉样沉积[13-17]，是否给药10个月后基因治疗组和治疗对照组小鼠脑内Aβ寡聚体存在差异，值得进一步研究。腺相关病毒注射到肌肉后，在基因治疗组小鼠表达单链抗体，而不表达EGFP，而在治疗对照组表达EGFP，而不表达单链抗体。不同的是单链抗体带有信号肽，可以分泌入肌肉纤维间，而EGFP无信号肽，只能在肌肉纤维内表达。可能肌肉表达的抗Aβ的单链抗体，最终进入循环系统甚至进入大脑内，对抗Aβ寡聚体的形成和神经毒性。

(本文图2～4见插图第3页)

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TherapeuticEffectofAnti-amyloidβPeptideSingle-chainAntibodyGeneMediatedbyAdeno-associatedVirusonAnimalAlzheimer’sDisease

CAI Jiong,NIU Na,LI Fang,WANG Shi-zhen

Department of Nuclear Medicine, PUMC Hospital, CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

CAI Jiong Tel: 010-65295517, E-mail: jiongcai@sina.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of recombinant adeno-associated virus carrying anti-amyloid β peptide single-chain antibody gene on Alzheimer’s disease (AD) in animal models.MethodsThe recombinant adeno-associated viruses were injected to the leg muscle of mutant amyloid precursor protein transgenic AD mice. The latency of the mice in Morris water maze was tested before and 3, 7, 10 months after drug administration. The animal brains were harvested 10 months after drug administration and sectioned for amyloid plaques staining.ResultsThe learning and memory abilities of AD model mice were improved significantly 3 months after gene drug administration. Ten months after gene therapy, the numbers of amyloid plaque in hippocampus of model mice decreased.ConclusionThe adeno-associated virus carrying anti-amyloid β peptide single-chain antibody gene has therapeutic effect on AD in model mice.

Alzheimer’s disease; adeno-associated virus; amyloid β peptide; single-chain antibody

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：151-155

蔡 炯 电话:010-65295517, 电子邮件:jiongcai@sina.com

R741.05

A

1000-503X(2011)02-0151-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.011

国家自然科学基金(30500573，30670741)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30500573，30670741)

2010-04-19)