系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中微小RNA-146a的表达

王海燕，李 扬，陈梅红，张 烜

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院风湿免疫科，北京 1007302中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所生物化学系， 北京 100005

·论著·

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中微小RNA-146a的表达

王海燕1，李 扬1，陈梅红2，张 烜1

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院风湿免疫科，北京 100730
2中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所生物化学系， 北京 100005

目的采用生物信息学和分子生物学技术相结合，寻找在系统性红斑狼疮(SLE)中特异性表达的微小RNA，为进一步研究微小RNA在SLE发病机制中的作用打下基础。方法查找与SLE发病相关的基因，采用微小RNA靶基因预测数据库预测SLE相关基因上的可能微小RNA靶位点，选择其相对应的微小RNA-146a,即hsa-miR-146a，采用实时荧光定量PCR方法检测SLE患者与正常人外周血单个核细胞(PBMCs)中微小RNA的表达差异。结果SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的循环阈值的差值高于正常对照组(4.52±1.18 比2.76±1.38，P=0.02)，hsa-miR-146a的表达量显著低于正常对照组。结论SLE患者PBMCs中hsa-miR-146a的表达水平降低，表明hsa-miR-146a在SLE发病机制中可能发挥一定的作用。

微小RNA；系统性红斑狼疮；外周血单个核细胞

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)发病机制复杂，被认为是自身免疫病的原型。大量研究证实，基因水平的免疫调节障碍及细胞因子代谢紊乱在SLE 中表现突出，直接或间接地参与了疾病的形成和发生发展过程。微小RNA在转录后水平调控基因的表达，在如凋亡[1]、分化[2]和细胞周期[3]中均发挥重要的作用并调节多种生物学信号通路。本研究利用生物信息学方法，借助于哺乳动物微小RNA靶基因预测数据库miRBase和TargetScan，预测出SLE相关基因上的可能微小RNA靶位点，选择其相对应的微小RNA，采用TaqMan探针实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技术检测其在SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的表达，为进一步研究微小RNA在SLE发病机制中的作用打下基础。

对象和方法

对象收集我院风湿免疫科门诊8例女性系统性红斑狼疮患者，年龄15～42岁，病情较为一致。所有患者的诊断均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE诊断标准。入组的SLE患者按SLE疾病活动指数评分≥10，临床表现均具有血尿、蛋白尿、低补体、抗双链DNA增高。8例正常对照皆来自年龄25～30岁的北京协和医院健康志愿献血者，年龄和性别匹配。

试剂和仪器淋巴细胞分离液购自国药集团化学试剂有限公司；Trizol购自美国Invitrogen公司； hsa-miR-146a TaqMan®MicroRNA Assays和RUN6 TaqMan®MicroRNA Assays及TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription Kit 及 TaqMan 2× Universal PCR Master Mix购自ABI公司，ABI PRISM7500 Real-Time PCR 扩增仪(美国应用生物技术系统公司)，荧光定量 96 孔板(美国应用生物技术系统公司)。

采用微小RNA靶基因预测数据库预测SLE相关基因上的可能微小RNA靶位点结合目前的文献报道，查找并总结出与SLE发病相关的基因。在miRBase 13.0(http://microrna.sanger.ac.uk)和TargetScan 5.2(http://www.targetscan.org)数据库中分别查找这些基因上的可能微小RNA靶位点。分别统计每个微小RNA靶位点的出现频率、每个微小RNA靶位点在不同的SLE相关基因上的出现频率(作用靶基因数)。在靶位点出现频率较高的微小RNA、靶位点在不同的SLE相关基因上出现频率较高的微小RNA、以及miRBase 13.0和TargetScan 5.2两大数据库预测结果较一致的微小RNA中随机选择hsa-miR-146a，对其在SLE患者PBMCs中的表达量做进一步实验验证。

外周血单个核细胞的提取抽取SLE患者及正常对照人群外周静脉血4 ml，抗凝。用常规淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMCs。分离出的乳白色PBMCs层用1倍体积的PBS洗涤两次。洗涤后用PBS定容至1 ml，吹打混匀；用细胞计数板计数。

PBMCs中总RNA的提取及质量检测将患者及健康对照者PBMCs悬液转移至1.5 ml 无RNA酶的EP管中，Trizol法提取总RNA，提取的总RNA加入35 μl 无RNA酶的水，于55～60℃水浴5～10 min,使RNA充分溶解。用核酸紫外分析仪检测RNA浓度，保证OD260/280位于1.8～2.0，并电泳检测RNA质量，剩余的RNA冻存于-80℃备用。

反转录反应将SLE患者及正常人PBMCs中提取的总RNA用RNase-free水稀释成浓度为2 ng/μl。应用ABI公司的TaqMan®微RNA反转录试剂盒，反应体系为15 μl。每个0.2 ml RNase-free的EP管中分别加入10×RT酶(50 U/μl)1.00 μl，10×RT缓冲液1.5 μl，RNA酶抑制剂(20 U/μl)0.19 μl，无RNA酶水 4.16 μl，dNTP (10 mmol/L)0.15 μl,Total RNA 5 μl，5×RT引物3 μl。均于冰上加样。反应参数为：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min；4℃无限延伸。选用RUN6为内参。

实时定量PCR反应采用ABI公司的TaqMan®2×通用PCR混合液，20 μl PCR反应体系(μl)：Taqman 探针1.00 μl；cDNA 3.00 μl；PCR 混合液10.00 μl；ddH2O 6.00 μl。PCR循环条件：95℃ 10 min(95℃ 15 s→60℃ 60 s)40个循环。

统计学处理采用SPSS 16.0 软件包。用循环阈值的差值(△Ct)(目标基因的Ct 值减去内参基因的Ct 值)对实时定量PCR 的结果进行相对定量分析，数据以均数±标准差表示，均值的比较采用t检验进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

与SLE发病相关的基因与SLE发病相关基因可分为细胞凋亡相关因子、细胞因子相关、转录活化因子及信号相关因子、干扰素相关因子等几类(表1)。

与SLE发病相关基因在微小RNA靶基因预测数据库中的查询结果在两大微小RNA靶基因预测数据库miRBase 13.0和TargetScan 5.2中查找出与SLE发病相关基因上的可能微小RNA靶位点(表2)。

qRT-PCR方法检测hsa-miR-146a在SLE患者及正常人PBMCs中的表达SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的△Ct值高于正常对照组(4.52±1.18 比2.76±1.38，P=0.02)。

讨 论

继小干扰RNA后，人们发现微小RNA也是一种对基因表达调控发挥重要作用的非编码小RNA。人的微小RNA-146家族有两个成员：146a和146b，分别位于5和10号染色体上。有报道hsa-miR-146a与免疫性疾病及免疫反应相关[4-5]。Hsa-miR-146a还可在人类肺泡上皮细胞中调节急性炎症反应，其表达的快速增高为固有免疫反应提供了一个新的负向调节机制[6]。

表 1 与SLE发病相关的基因

SLE：系统性红斑狼疮；TNF：肿瘤坏死因子；TFAR：TF-1细胞凋亡相关基因；IL：白细胞介素；IFN：干扰素；TGF：转化生长因子；MMP：基质金属蛋白酶；CIS：细胞因子信号传导抑制蛋白；TNFSF：肿瘤坏死因子配体超家族成员；TRAF：肿瘤坏死因子受体相关因子；ATG：自噬相关基因； TRAIL：肿瘤坏死因子凋亡相关配体； GATA：结合蛋白；STAT：信号转导及活化转录因子；SOCS：细胞因子信号转导抑制因子；BLK： B淋巴细胞激酶；SLAMF：淋巴细胞信号激活分子；IRF：干扰素调节因子；IFIT：应激相关蛋白；GIMAP5：免疫相关蛋白5核苷酸结合GTP酶；CD40LG： CD40配体基因；PDCD：程序性凋亡细胞；MERTK：突变受体酪氨酸激酶基因；KIR：杀伤细胞免疫球蛋白样受体；TLR：toll 样受体；MECP：甲基结合蛋白；PRF：穿孔素；ITGAL：增殖诱导配体(TNF家族)；CTLA：细胞毒性T淋巴细胞抗原；CRP：C反应蛋白

SLE: systemic lupus erythematosus; TNF: tumor necrosis factor；TFAR: TF-1 cell apoptosis-related gene；IL: interleukin；IFN: interferon；TGF: transforming growth factor；MMP: matrix metallopeptidase；CIS: cytokine-inducible SH2 protein；TNFSF: tumor necrosis factor superfamily；TRAF: TNF receptor-associated factor；ATG: autophagy gene；TRAIL: tumor necrosis factor-related apoptosis-including ligand；GATA: binding protein；STAT: signal transducer and activator of transcription；SOCS: suppressor of cytokine signaling；BLK: B lymphocyte kinase；SLAMF: signaling lymphocyte activation molecule F；IRF: interferon regulatory factor；IFIT: interferon-induced with tetratricopetide；GIMAP: GTPase of immunity-associated nucleotide binding protein；CD40LG: CD40 ligand gene；PDCD: programmed cell death； MERTK: MER receptor tyrosine kinase gene；KIR: killer cell immunoglobulin-like receptor；TLR: toll-like receptor；MECP: methyl-CpG-binding protein；PRF: perforin；ITGAL: proliferation-inducing ligand (TNF family)；CTLA: cytotoxic T lymphocyte antigen；CRP: C-reactive protein

表 2 两个微小RNA靶基因预测数据库检索结果

研究表明，长度为20～25个核苷酸的微小RNA通过与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)不完全互补结合，引起相应靶mRNA的降解或翻译抑制效应从而下调靶基因表达[7-8]。本研究显示SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的表达量显著低于正常人，因而可以初步推测hsa-miR-146a的表达异常在SLE发病中可能发挥一定的作用。两大数据库预测的hsa-miR-146a可能作用的与SLE相关的靶基因有CD40LG、IRF5、PRF1。

综上，本研究探讨了微小RNA在SLE患者外周血PBMCs中的特征性表达，发现SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的表达量显著低于正常人，为进一步研究微小RNA在SLE发病机制中的作用提供了有益的线索。

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ExpressionofMicroRNA-146ainPeripheralBloodMononuclearCellsin
PatientswithSystemicLupusErythematosus

WANG Hai-yan1, LI Yang1, CHEN Mei-hong2，ZHANG Xuan1

1Department of Rheumatology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China
2Department of Biochemistry,Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China

ZHANG Xuan Tel:010-88068177, E-mail:zxpumch2003@yahoo.com.cn;

ObjectiveTo explore the expression pattern of microRNAs in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with systemic lupus erythematosus (SLE), with an attempt to identify the role of microRNA in the pathogenesis of SLE.MethodsSLE-related genes were searched from the published literatures. Using the microRNA target gene prediction databases, we predicted the putative microRNA targets in these SLE-related genes. For some of the corresponding microRNAs (hsa-miR-146a), quantitative real-time polymerase chain reaction was performed to determine the expression levels of these microRNAs in PBMCs of SLE patients (SLE group) and healthy controls (control group).ResultThe discrepancy of cycle threshold of hsa-miR-146a in PBMCs was significantly higher in SLE group (4.52±1.18) than in control group (2.76±1.38) (P=0.02), and the expression level of hsa-miR-146a was significantly lower in SLE group.ConclusionThe expression of hsa-miR-146a decreases in SLE patients, indicating that hsa-miR-146a may play a role in the pathogenesis of SLE.

microRNA;systemic lupus erythematosus; peripheral blood mononuclear cells

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：185-188

张 烜 电话：010-88068177，电子邮件：zxpumch2003@yahoo.com.cn；
陈梅红 电话：010-67884240，电子邮件：chenmhxc@gmail.com

R593.24+1

A

1000-503X(2011)02-0185-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.017

教育部新世纪优秀人才计划(NCET-04-0191)，国家自然科学基金(30400410)，北京自然科学基金(7052052)和国家重点基础研究发展计划项目子课题(2007CB512405)Supported by the Ministry of Education’s New Century Excellent Talents Scheme (NCET-04-0191), the National Natural Sciences Foundation of China(30400410), the Natural Sciences Foundation of Beijing(7052052), and the National Basic Research Program Sub-topics of China(2007CB512405)

CHEN Mei-hong Tel: 010-67884240,E-mail: chenmhxc@gmail.com

2010-05-04)