他克莫司对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及其机制的研究

刘致中， 赵黎明， 武 飞， 岳长久， 李建新

(内蒙古医学院第三附属医院泌尿外科， 内蒙古 包头 014010)

他克莫司对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及其机制的研究

刘致中， 赵黎明△， 武 飞， 岳长久， 李建新

(内蒙古医学院第三附属医院泌尿外科， 内蒙古 包头 014010)

目的探讨他克莫司对大鼠肾缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用及机制。方法将60只健康雄性Wistar大鼠随机分为3组：假手术组、I/R组和他克莫司处理组,每组各4个时点( 0.5 h、2 h、6 h、24 h)。建立肾I/R损伤模型;检测各组大鼠血清肌酐(Cr)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;用光学显微镜观察各组大鼠肾组织病理变化；用免疫组化法检测Fas和caspase-3蛋白的表达。结果在相应再灌注各时点，他克莫司处理组血清Cr、TNF-α和MDA水平均低于I/R组(P<0.05)，而他克莫司处理组血清SOD活性高于I/R组(P<0.05)。他克莫司处理组肾组织损伤程度明显轻于I/R组。与假手术组比较,I/R组凋亡蛋白Fas和caspase-3表达水平显著增加(P<0.05),而他克莫司处理组凋亡蛋白Fas和caspase-3表达水平则低于I/R组(P<0.05)。结论他克莫司能有效抑制I/R引起的自由基产生、肾小管上皮细胞凋亡以及TNF-α水平降低，表明他克莫司对大鼠肾I/R损伤具有保护作用。

他克莫司； 再灌注损伤；肿瘤坏死因子； Fas； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤是临床常见的病理生理变化, 常见于急性失血、中毒性休克和器官移植手术等过程中。其发病机制尚未完全阐明。他克莫司是近年来在临床常用的一种新型免疫抑制剂,新近有文献报道新型免疫抑制剂他克莫司在使用过程中,低剂量的他克莫司预处理可以减轻组织或器官的I/R损伤[1]。本文旨在研究他克莫司对大鼠肾I/R损伤的保护作用, 并探讨其作用机制。为他克莫司在临床上用于肾I/R损伤的防治提供实验依据。

材 料 和 方 法

1试剂

他克莫司注射液由安斯泰来制药有限公司惠赠，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。兔抗大鼠Fas和caspase-3(Lab Vision)，Ⅱ抗免疫组化试剂盒购于天津津脉基因测绘技术有限公司。

2方法

2.1实验动物与分组 选用健康雄性Wistar大鼠60只(购自内蒙古大学动物实验中心)，重量220-260 g。随机分为3组：假手术(sham)组、I/R组和他克莫司处理(FK506+I/R)组,每组20只动物，各组又按时相不同分为0.5 h、2 h、6 h、24 h 4个亚组, 每个亚组5只动物。

2.2动物模型的建立及标本采集 建立动物模型，所有动物实验前禁食12 h，自由饮水，将大鼠以20%乌拉坦5 mL/kg腹腔内注射麻醉后，作腹部正中切口，切除右肾，小心分离左肾动脉，保护输尿管，用无创动脉夹夹闭左肾动脉,45 min后恢复灌流，肾脏由暗红色变为鲜红色，表明再灌注成功。假手术组开腹后切除右肾, 分离左肾动脉, 但不夹闭左肾动脉；I/R组建立肾脏I/R损伤模型, 并于手术前6 h从尾静脉注射生理盐水1 mL;他克莫司处理组建立肾脏I/R损伤模型，并于手术前6 h从尾静脉注射他克莫司注射液( 0.5 mg/kg)；于再灌注后0.5 h、2 h、6 h、24 h 处死动物,处死前下腔静脉采血3 mL以备进行肾功能及血清TNF-α、MDA、SOD指标测定。并切除左肾,切除的左肾部分组织用10%中性甲醛固定以制备石蜡切片。

2.3血清肌酐(creatinine,Cr)、TNF-α、MDA含量和SOD活性的测定 从下腔静脉取血3 mL, 离心后取血清。Cr采用全自动生化分析仪测定，TNF-α含量测定采用酶联免疫吸附法(ELISA法)，MDA含量和SOD活性采用化学比色法，均按检测试剂盒说明书操作。

2.4病理组织学观察 切除的左肾部分肾组织于10%中性甲醛溶液中固定24 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，切成4 μm厚的连续冠状石蜡切片。按病理学常规制片、HE染色,光学显微镜观察肾组织损伤情况。

2.5免疫组化检测Fas和caspase-3的表达 切取4 μm厚的石蜡切片, 常规脱蜡至水。严格按兔二步法免疫组化试剂盒操作。Fas和caspase-3阳性细胞结果为胞浆内呈黄色或棕黄色染色，阴性对照以PBS代替Ⅰ抗。每张切片随机采集5个高倍视野(×400)，每个视野计100个细胞，计算阳性细胞数。阳性细胞数为0，记作“-”;阳性细胞数25%以下为“+”;阳性细胞数25%-50%为“++”;阳性细胞数51%-75%为“+++”;阳性细胞数75%以上为“++++”。将表达强度评分，“+”为1分，“++”为2分，“+++”为3分，“++++”为4分。

3统计学处理

结 果

1血清Cr和TNF-α含量的变化

在相应再灌注各时点，I/R组与他克莫司处理组大鼠Cr值均高于假手术组；随着再灌注时间的延长，I/R组Cr值明显升高；在再灌注2 h、6 h和24 h，他克莫司处理组Cr的水平显著低于I/R组(P<0.05)，I/R组Cr的水平与假手术组比差异显著(P<0.05)，见表1。随着再灌注时间的延长，I/R组血清TNF-α含量明显升高；而他克莫司处理组随着再灌注时间延长血清TNF-α含量升高不明显，再灌注24 h，TNF-α含量反而出现降低；在再灌注各时点，他克莫司处理组TNF-α含量均显著低于I/R组(P<0.05)，见表1。

表1 实验各组不同再灌注时点Cr和TNF-α水平比较

2血清MDA含量和SOD活性的变化

与同一时点假手术组比较, I/R组大鼠血清MDA含量较假手术组明显升高(P<0.05)；在再灌注相应时点他克莫司处理组血清MDA含量低于I/R组(P<0.05)。在相应再灌注各时点，与假手术组比较, I/R组血清SOD活性显著降低(P<0.05)；他克莫司处理组血清SOD与I/R组比较，差异显著(P<0.05)；在再灌注6 h、24 h，假手术组与他克莫司处理组也有显著差异,见表2。

表2 实验各组不同再灌注时点血清MDA含量和SOD活性的比较

3肾组织病理变化

光镜下，假手术组肾小球、肾小管结构基本正常; I/R 组和他克莫司处理组在恢复再灌注后的0.5-2 h肾间质血管内都有充血表现，其中以0.5 h表现明显。以后充血表现逐渐改善。I/R 组在再灌注6 h、24 h出现肾小管扩张，肾小管上皮细胞肿胀,细胞脱落,肾间质血管扩张、充血伴炎症细胞浸润; 24 h小管形态损伤最严重，肾小管轮廓结构消失，有的出现不同程度的片状坏死。而他克莫司处理组病变程度较I/R 组明显减轻，仅出现肾小管扩张，肾小管上皮细胞肿胀，间质血管扩张、充血，见图1。

Figure 1. The pathological changes of renal tissues at 24 h(×400).A:sham group; B:I/R group; C: FK506+I/R group.

4他克莫司对Fas蛋白表达的影响

Fas阳性细胞表达为胞浆内呈黄色或棕黄色染色，阳性表达主要在肾小管上皮细胞以近曲小管、远曲小管上皮细胞明显，肾小球未见表达。I/R 组在再灌注的各时点表达均高于假手术组，在再灌注2 h、6 h、24 h，Fas蛋白表达显著高于假手术组(P<0.05)，I/R组和他克莫司处理组的差异显著(P<0.05)；再灌注6 h、24 h假手术组与他克莫司处理组差异显著(P<0.05)，见图2、表3。

5他克莫司对caspase-3蛋白表达的影响

Caspase-3阳性细胞表达为胞浆内呈黄色或棕黄色染色，阳性表达主要在肾小管上皮细胞以近曲小管、远曲小管上皮细胞明显，肾小球未见表达。I/R 组在再灌注的各时点表达均高于假手术组，在再灌注2 h、6 h、24 h，caspase-3蛋白表达显著高于假手术组(P<0.05)，I/R组和他克莫司处理组的差异显著(P<0.05)；再灌注24 h假手术组与他克莫司处理组差异显著(P<0.05)，见图3、表3。

Figure 2. Fas expression detected by immunohistochemistry at 24 h(×400). A: sham group; B:I/R group; C: FK506+I/R group.

Figure 3. Caspase-3 expression detected by immunohistochemistry at 24 h(×400). A:sham group; B:I/R group; C:FK506+I/R group.

表3 实验各组不同再灌注时点肾组织Fas和caspase-3表达强度(分)的变化

讨 论

他克莫司是从Tsukubaensis链球菌中提取出来的大环内酯类抗生素，通过抑制T辅助细胞释放IL-2及T杀伤细胞的增殖，从而抑制细胞和体液免疫反应，具有调节免疫应答的作用，是近年来在器官移植中运用比较广泛的一种新型免疫抑制剂[1]，研究发现它不仅能减轻再灌注后肾脏损伤的程度，而且能够使损伤后的肾脏得到一定程度的修复和再生[2]。

近年研究表明，炎性细胞因子在肾I/R损伤的发病机制中起重要作用，其中TNF-α是参与肾I/R损伤的一个重要调节因子。肾I/R损伤时，TNF-α作为炎症细胞因子被释放，通过直接的细胞毒作用、诱导肾小球纤维蛋白沉积、收缩血管以致肾小球滤过率下降以及聚集中性粒细胞和单核细胞等亦能导致肾脏损伤[3,4]。因此，阻断炎性细胞因子的释放可能是减少I/R损伤的一条途径。本实验结果显示，I/R组不同再灌注时点TNF-α水平明显高于他克莫司处理组(P<0.05)，说明术前给予他克莫司预处理，可以降低I/R肾组织TNF-α水平，从而减轻肾I/R损伤程度。

氧自由基学说在肾I/R损伤机制中的作用已经得到广泛证实，在肾I/R过程中，氧自由基的大量形成和脂质过氧化的增加是细胞损伤的主要病理过程之一。SOD是自由基的重要清除剂之一，也是体内非常重要的抗氧化酶[5，6]。缺血再灌注的过程中，肾脏组织会产生大量的氧自由基，而肾脏内的SOD等氧自由基清除剂因为缺血缺氧抑制了其活性，不能有效地清除氧自由基，以致氧自由基大量堆积。氧自由基能够损伤生物膜上的脂质，最终产生MDA，MDA也有细胞毒性作用，从而加剧I/R损伤[7]。我们的实验结果表明，他克莫司处理组MDA含量明显低于I/R组(P<0.05)，SOD活性明显高于I/R组(P<0.05)。I/R组血Cr明显高于他克莫司处理组。这表明他克莫司提高了SOD 的活性，保存有较好的氧自由基清除能力，能够减轻I/R对肾组织的损伤。

研究表明[8],肾I/R损伤后除发生细胞坏死外,细胞凋亡也是其重要的死亡形式。细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控,Fas及其配体FasL同属于TNF家族成员,当细胞表面表达Fas时,可激活FasL使两者结合,使Fas死亡区交联,产生神经酰胺,通过某种途径,激活内源性核酸内切酶,引起细胞凋亡,并向细胞内传递死亡信号,数小时内导致细胞死亡[9，10]。在很多病理条件下,凋亡相关蛋白Fas可通过激活caspase-3而介导凋亡的发生。Caspase-3是人类白细胞介素1β转化酶家族的重要成员之一,是激活细胞凋亡早期阶段的关键蛋白酶,并在细胞凋亡过程中起着中心环节的作用。活化的caspase-3可通过水解特异性蛋白底物,从多方面促进凋亡的发生。如对结构蛋白及看家蛋白actin、fodrin keratin等的水解,使细胞骨架结构破坏[11]，最终导致细胞凋亡。

本实验结果表明, I/R组Fas和caspase-3蛋白表达显著升高,说明阻断肾脏血运后，在恢复再灌注期间可以诱导肾脏Fas和caspase-3蛋白的表达，引起细胞凋亡。Fas和caspase-3蛋白于实验各组肾小管上皮细胞均有表达,以肾近曲小管和远曲小管表达较明显,而肾小球未见表达。进一步观察,与假手术组相比, I/R组Fas和caspase-3在缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞表达明显增强,阳性细胞数显著增加;经他克莫司预处理后,肾小管上皮细胞Fas和caspase-3不仅表达强度显著减弱,而且阳性细胞数也明显减少。上述结果提示,他克莫司具有抑制Fas和caspase-3表达的作用,从而减少肾小管上皮细胞凋亡的发生。

综上所述,他克莫司能通过降低肾I/R损伤时TNF-α和MDA水平，提高SOD活性，保护肾功能，并抑制细胞凋亡的发生，对大鼠肾I/R损伤具有一定的保护作用。

[1] Yang CW, Ahn HJ, Han HJ, et al. Pharmacological preconditioning with low-dose cyclosporine or FK506 reduces subsequent ischemia/reperfusion injury in rat kidn-ey[J].Transplantation, 2001,72(11):1753-1759.

[2] Sakr MF, McClain CJ, Gavaler JS, et al. FK506 pre-treatment is associated with reduced levels of tumor necrosis factor and interleukin 6 following hepatic ischemia/ reperfusion[J]. J Hepatol,1993,17(2):301-307.

[3] Meldrum KK, Hile K, Meldrum DR, et al. Simulated ischemia induces renal tubular cell apoptosis through a nuclear factor-κB dependent mechanism[J]. J Urol,2002, 168(1):248-252.

[4] Meldrum KK, Meldrum OR, Meng X, et al. TNF-α-dependent bilateral renal injury is induced by unilateral renal ischemia-reperfusion[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282(2):H540-H546.

[5] 卢舜飞，孙丽娜，沈 佳，等.黑木耳多糖对抗大鼠慢性缺血性脑损伤[J].中国病理生理杂志，2010，26(4)：721-724.

[6] 朱颖婷,邓新国,高 杨,等.碘酸钠诱导大鼠视网膜损伤的病理改变和SOD、CAT的变化[J].中国病理生理杂志，2010，26(9)：1851-1854.

[7] Wink DA, Mitchell JB. Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide[J]. Free Radic Biol Med,1998,25(3):434-456.

[8] Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N,et al.Induction of apoptosis in ischemia-reperfusion model of mouse kidney: possible involvement of Fas[J]. J Am Soc Nephrol, 1998, 9(4):620-631.

[9] 卫立辛, 钱其军. Fas介导凋亡的免疫学研究进展[J].国外医学：生理、病理学与临床分册, 1997, 17(4):289-291.

[10]Itoh N,Nagata S.A novel protein domain required for apoptosis.Mutational analysis of human Fas antigen[J]. J Biol Chem, 1993, 268(15):10932-10937.

[11]Kitazawa M, Anantharam V, Kanthasamy AG. Dieldrin induces apoptosis by promoting caspase-3-dependent proteolytic cleavage of protein kinase Cδ in dopaminergic cells: relevance to oxidative stress and dopaminergic degeneration[J].Neuroscience,2003,119(4):945-964.

Effectoftacrolimusonrenalischemia/reperfusioninjuryinrats

LIU Zhi-zhong, ZHAO Li-ming, WU Fei, YUE Chang-jiu, LI Jian-xin

(DepartmentofUrology,TheThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege,Baotou014010,China.E-mail:zhao_55liming@sina.com)

AIM: To investigate the protective effects and mechanism of tacrolimus on renal ischemia/reperfusion(I/R) injury in rats.METHODSSixty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: sham-operated group, I/R group and tacrolimus group. After the renal I/R injury model was established, the serum content of creatinine(Cr), tumor necrosis factor-α(TNF-α)and malondialdehyde(MDA) and activity of superoxide dismutase(SOD) were measured at reperfusion time points of 0.5 h, 2 h, 6 h and 24 h. The renal histopathological lesions and the expression of Fas and caspase-3 were observed by the methods of microscopy and immunohistochemistry, respectively.RESULTSAt all the 4 time points, the levels of Cr, TNF-α and MDA in tacrolimus group were lower than those in I/R group(P<0.05). The SOD activity in tacrolimus group was higher than that in I/R group. Compared with I/R group, the renal histopathological lesions were improved, and the levels of Fas and caspase-3 were significantly decreased in tacrolimus group(P<0. 05).CONCLUSIONTacrolimus inhibits the production of free radical, the expression of TNF-α and apoptosis of renal tubular epithelial cells in renal I/R injury in rats, indicating that tacrolimus has protective function against renal I/R injury.

Tacrolimus; Reperfusion injury; Tumor necrosis factor; Fas; Caspase-3

R697

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-034

1000-4718(2011)02-0386-04

2010-06-18

2010-11-19

△ 通讯作者 Tel:0472-5992751; E-mail: zhao_55liming@sina.com