晚期缺血预适应促进低氧诱导因子的表达,减轻肾脏缺血再灌注损伤*

徐夏莲， 蒋素华， 许迅辉， 刘 红， 丁小强

(复旦大学附属中山医院肾内科，上海 200032)

晚期缺血预适应促进低氧诱导因子的表达,减轻肾脏缺血再灌注损伤*

徐夏莲， 蒋素华， 许迅辉， 刘 红， 丁小强△

(复旦大学附属中山医院肾内科，上海 200032)

目的探讨晚期缺血预适应对肾脏缺血再灌注损伤的作用，以及低氧诱导因子1α(HIF-1α)在其中的作用。方法将雄性C57/BL6N小鼠随机分为3组：假手术组(sham)、缺血再灌注组(IR)和缺血预适应组(IPC)。采用夹闭双侧肾蒂30 min后恢复灌注的方法建立肾缺血再灌注小鼠模型；缺血预适应组4 d前给予肾脏15 min预缺血。观察缺血预处理对再灌注后不同时点血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、肾组织形态学和细胞凋亡的影响。采用免疫组化及Western印迹法，分析HIF-1α在肾组织的表达；采用实时定量RT-PCR法，检测血管内皮生长因子(VEGF)和葡萄糖转运子-1(Glut-1)的mRNA表达。结果再灌注24 h后，IPC组小管间质损伤程度较IR组显著减轻，Scr、BUN水平以及小管上皮细胞凋亡明显下降。IPC组的HIF-1α核内表达显著高于IR组，且HIF-1下游靶基因VEGF和Glut-1的mRNA表达亦显著增加。结论晚期缺血预适应能够显著改善缺血再灌注后肾脏的形态和功能，这种保护作用可能与促进低氧诱导因子高表达有关。

肾； 缺血预处理； 缺血再灌注； 低氧诱导因子

急性肾损伤临床常见，缺血是引起急性肾损伤的重要因素[1]。缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC)是指预先短暂的缺血性刺激可使脏器对随后长时间的缺血产生耐受，它能系统而全面地调动机体的保护反应。在其它器官研究中发现，IPC具有双相保护作用，与早期缺血预适应相比，晚期缺血预适应需要合成新的蛋白质，保护效应在预缺血后12-24 h出现，可以持续数天到数周，作用持久而稳定[2-4]。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是维持氧自稳平衡的核心调控因子，以往研究发现，HIF高表达在心、脑等脏器的缺血预适应中起重要作用[5, 6]，而在肾脏IPC中的作用尚不清楚。本研究通过构建小鼠肾脏晚期缺血预适应模型，旨在探讨晚期缺血预处理是否通过稳定HIF高表达从而发挥肾脏保护作用。

材 料 和 方 法

1材料

Ⅰ抗为兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗体(Abcam)，DAB显色试剂盒(Sigma)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜(Sigma)，ECL Plus 试剂盒(中国碧云天生物公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白质定量试剂盒(中国康成生物公司)，Trizol reagent(Invitrogen)，SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒(Invitrogen)，引物由上海生工合成。

2方法

2.1动物分组与动物模型建立 雄性C57BL/6N小鼠，22-26 g(SPF级，中国科学院上海实验动物中心)，随机分为3组：(1)假手术组(sham)，只分离两侧肾蒂，不进行夹闭；(2)缺血再灌注组(IR)，用无损伤动脉夹持续夹闭两侧肾蒂30 min，然后恢复灌注；(3)缺血预处理组(IPC)，第0 d夹闭两侧肾蒂15 min，造成预缺血，间隔4 d后，再次缺血30 min，然后恢复灌注。再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、1周和2周处死大鼠(每个时点n= 6)。

2.2肾功能和肾脏组织形态学检测

① 肾功能检测 眶下静脉丛采血，分离血清，使用日立全自动生化分析仪酶法测定小鼠尿素氮和肌酐浓度。

② 肾组织病理学检查 10%中性甲醛固定肾组织，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚度为4 μm)后，过碘酸-雪夫氏染色(periodic acid schiff, PAS)染色分析。急性肾小管间质损伤程度分级根据盲法原则由肾脏病理医师完成，每个标本在200倍光镜下随机选取外髓质部10个不重叠视野，正常为0分，受损肾小管间质 < 25%为1分，25%-50%为2分，50%-75%为3分，>75%为4分，以此作半定量分析并计算其均值，评分值越高代表损伤程度越重。

2.3细胞凋亡的检测 采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL法)，检测细胞凋亡，按照试剂盒(Roche)说明书进行操作。每一切片随机选取10个视野，在200倍光镜下，盲法观察染色阳性细胞数。

2.4免疫组织化学 石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温孵育10 min，浸入柠檬酸盐缓冲液微波修复20 min，正常山羊血清封闭20 min，滴加兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗体(1∶50)，4 ℃孵育过夜。PBS漂洗后滴加生物素标记的Ⅱ抗，37 ℃温箱孵育10 min，PBS漂洗。滴加ABC复合物，室温下孵育10 min，PBS漂洗；DAB显色；苏木素衬染，脱水，透明，封片。采PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。每张切片随机选取10个不重叠视野，应用Leica 图像分析系统进行分析。

2.5Western blotting检测 组织核蛋白的提取参照试剂盒(Active Motif)的操作步骤进行。BCA法测定蛋白浓度，60-80 μg蛋白上样，行PAGE电泳。转膜，封闭后，兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗体(1∶500稀释)或兔抗小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)单克隆抗体(1∶5 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG(1∶5 000稀释，Jackson)作为Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，最后曝光、显影、成像。应用图像分析软件对特异性条带进行吸光度分析。

2.6VEGF和Glut-1的mRNA检测(实时定量RT-PCR) 总RNA提取按Trizol reagent 说明书操作，cDNA的合成参照逆转录扩增试剂盒(TaKaRa)操作程序进行。以1 μL cDNA 为模板，应用SYBR green 试剂盒，在Bio-Rad iQ5 real-time PCR仪上进行PCR反应，总反应体积为25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环,72 ℃ 30 s，每次循环后于87 ℃收集荧光信号。扩增产物经熔解曲线检测特异性。目的基因扩增的Ct值根据相应标本中内参β-actin的表达量进行均一化计算。引物序列见表1。

表1 各引物序列及扩增产物长度

3统计学处理

结 果

1IPC对小鼠存活率、肾功能和肾脏组织形态学的影响

IR组小鼠存活率仅为57%，死亡集中于再灌注后48-72 h；IPC组和sham 组小鼠在整个实验过程中全部存活。与sham组相比，IR组血肌酐和尿素氮明显升高，再灌注后24 h达高峰，以后肾功能逐渐恢复；再灌注后2 h-2周，IPC组血肌酐均较IR组明显降低(P<0.05)，见图1。

PAS染色显示，IR组小鼠肾脏病理损伤明显，受损较重的部位集中于皮髓交界和外髓的近端小管，主要表现为小管上皮细胞死亡脱落，管腔扩张，间质水肿，炎症细胞浸润，肾小球无明显改变。IPC组小鼠肾脏只表现为少量的亚致死性损伤，如小管上皮刷状缘部分脱落和轻度的间质水肿，偶有细胞坏死，小管间质损伤评分较IR组显著改善(P<0.05)，见图2。

Figure 1. The effect of IPC on renal function at different time following reperfusion.±s. n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs IR group.

Figure 2. The effect of IPC on renal morphology(PAS staining,×200). 2h, 24h and 1 week following reperfusion, severe tubular dilation, tubular swelling and necrosis, casts and hemorrhage are present in the kidneys of mice subjected to IR, but these changes are drastically attenuated in mice subjected to IR injury after preconditioning. The score of outer medullary area for the histologic appearance and was significantly decreased in delayed IPC group mice compared with that in IP group mice.±s. n=6.**P<0.01 vs IR group.

2IPC对再灌注后肾小管上皮细胞凋亡的影响

再灌注后24 h，IR组小鼠出现明显的肾小管上皮细胞凋亡(TUNEL阳性)，凋亡细胞主要集中在皮髓交界和外髓质，肾小球内凋亡细胞较少。IPC组小鼠肾脏TUNEL阳性细胞数较IR组明显减少[(12.3±1.5)/高倍视野(high power field, HPF)vs(38.2±2.0)/HPF)P<0.01],见图3。

Figure 3. The effect of IPC on tubular cell apoptosis(TUNEL,×200). 6 h and 24 h following reperfusion, the number of TUNEL positive cell in renal outer medulla of IR group mice more than that in IPC group mice. The number of TUNEL positive cells in outer medulla was counted in IR group mice and delayed IPC group mice.±s. n=6. **P<0.01 vs IR group.

3IPC对再灌注后HIF-1α表达和分布的影响

如图4的Western blotting结果所示，与sham组相比，IR组和IPC组肾脏HIF-1α表达从再灌注后2 h就开始增加，24 h达高峰，缺血预处理组HIF-1α高水平表达持续到再灌注后48 h，且再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和1周肾脏HIF-1α的蛋白表达量均显著高于单纯IR组，差异显著(P<0.01)。如图5免疫组织化学结果所示，sham组HIF-1α阳性细胞较少；IR组HIF-1α阳性细胞在内髓质集合管分布较多，其次沿皮髓交界和外髓质坏死小管周围的残存细胞分布；经15 min缺血预处理后，IPC组HIF-1α在上述部位上皮细胞的胞浆、核内表达均进一步增强。

4IPC对HIF-1α靶基因VEGF和Glut-1表达的影响

IPC组肾脏VEGF mRNA表达从再灌注后12 h出现明显升高，48 h达到高峰，并以较高水平持续至再灌注后1周，再灌注后12 h、24 h、48 h、72 h和1周肾脏VEGF mRNA表达量均高于单纯IR组(P<0.05)。IPC组肾脏Glut-1 mRNA表达从再灌注后6 h逐渐升高，72 h达到高峰，以后逐渐减少但仍维持于较高水平，再灌注后12 h、24 h、48 h、72 h、1周和2周肾脏Glut-1 mRNA表达量均高于单纯IR组(P<0.05)，见图6。

Figure 4. The effect of IPC on HIF-1α expression following reperfusion(Western blotting analysis).±s. n=6.**P<0.01 vs IR group.

Figure 5. Expression and location of HIF-1α at 24 h following reperfusion in each group(immunohistochemistry,×200).

Figure 6. The effect of IPC on mRNA expression of VEGF and Glut-1 following reperfusion.±s.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs IR group.

讨 论

本研究采用持续夹闭两侧肾蒂30 min然后恢复灌注的方法建立肾脏IR模型，发现再灌注后肾脏出现明显的病理性损伤，表现为大量小管上皮细胞死亡脱落，填塞管腔，管型形成，肾小管变形，间质水肿，炎症细胞浸润；与肾脏形态学变化相伴随的是肾功能急剧下降，小鼠存活率下降至57%，这与既往报道一致，说明肾脏IR损伤的模型构建成功[7]。相反，4 d前如果给予短时间缺血预处理，上述情况全部明显改善，表现为IPC组肾小管间质损伤明显减轻，肾功能显著改善且较早恢复至正常水平，小鼠存活率升高至100%。目前研究证实，细胞凋亡是急性缺血性肾衰竭时肾小管上皮细胞死亡的重要形式[8]。本实验结果亦显示，IR组小鼠出现较多的肾小管细胞凋亡，而IPC组小管细胞凋亡较IR组明显减少，说明短时间缺血预处理能显著增加细胞活性和耐缺血缺氧能力，但其机制尚不清楚。

缺氧是器官缺血再灌注损伤发生过程中的最早环节和关键因素，而低氧诱导因子(HIF)在细胞氧自稳调节中起重要作用。近年来，HIF在缺血预适应中的作用逐渐受到重视。本实验发现，肾脏晚期缺血预适应后HIF-1α表达明显增加：IPC组肾脏HIF-1α表达从再灌注后2 h就开始增加，24 h达高峰，以后逐渐减少，但仍维持于较高水平，其表达规律与缺血预处理的肾功能保护时间规律较一致；且免疫组化亦显示IPC组HIF-1α阳性细胞和分布范围较IR组明显增加；IPC组HIF-1α靶基因VEGF和Glut-1mRNA表达的增加进一步验证了上述实验结果。既往我们研究发现，利用CoCl2或8%低氧预处理激活HIF-1α可以有效减轻肾脏缺血再灌注损伤[9]。其他研究者发现给予脯氨酸羟化酶抑制剂或CO等预处理激活HIF-1α同样对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用[10, 11]。提示短时间预缺血可能通过激活HIF-1发挥肾脏保护作用。HIF-1调控包括VEGF和Glut-1在内的多种低氧应答基因的表达，这些基因产物或能增加缺氧组织的氧供和运输能力，或能降低细胞耗氧量，从而缓解器官氧供求之间的矛盾以维持内环境稳定，使机体对缺血缺氧产生耐受和适应[12, 13]。单纯缺血再灌注后，HIF-1α和靶基因的表达均有所上调，说明IR组也出现了一定程度的适应性反应，但可能其产生的适应性反应不足以抵消缺血再灌注引起的损伤效应，最终导致肾脏结构和功能的破坏。

总之，晚期缺血预适应对肾脏有明确的保护作用，能显著减轻IR引起的肾脏功能和病理性损伤，提高小鼠存活率。其保护作用可能与促进低氧诱导因子和包括VEGF和Glut-1在内的靶基因表达有关，在此基础上寻找模拟缺血预处理的药物用于临床治疗将具有更重要的意义。

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Protectiveeffectofdelayedischemicpreconditioningonrenalischemia/reperfusioninjuryviainductionofhypoxiainduciblefactor

XU Xia-lian, JIANG Su-hua, XU Xun-hui, LIU Hong, DING Xiao-qiang

(DepartmentofNephrology,ZhongshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:dxq93216@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the effects of delayed ischemic preconditioning on renal ischemia-reperfusion injury in mice and to study the role of hypoxia inducible factor 1α(HIF-1α).METHODSMale C57/BL6N mice were randomly divided into 3 groups: sham operation group(sham), ischemia/reperfusion group(IR) and ischemic preconditioning group(IPC). Thirty-minute ischemia was induced by clamping renal bilateral pedicles followed by reperfusion in IR group. Fifteen-minute pre-ischemia was performed 4 days before IR in IPC group. Serum creatinine(Scr), blood urea nitrogen(BUN), kidney morphology and apoptosis were observed at different time points following reperfusion. The expression of HIF-1α in the renal tissues was evaluated by the methods of immunohistochemistry and Western blotting analysis. The mRNA expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and glucose transporter-1(Glut -1) was detected by real-time quantitative RT-PCR.RESULTSCompared with IR group at 24 h following reperfusion, acute tubulointerstitial injury was significantly relieved in IPC group. The levels of Scr and BUN, and apoptosis of tubular epithelial cells were also decreased in IPC group. Nuclear expression of HIF-1α was higher in IPC group than that in IR group. The mRNA expression of VEGF and Glut-1, the target genes of HIF-1, was also increased significantly in IPC group.CONCLUSIONDelayed ischemic preconditioning attenuates both morphologic and functional injuries induced by renal ischemia/reperfusion. This protective effect may be related to the increased expression of hypoxia inducible factor.

Kidney; Ischemic preconditioning; Ischemia-reperfusion; Hypoxia-inducible factor

R692.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-021

1000-4718(2011)02-0320-06

2010-08-30

2010-11-08

国家自然科学基金资助项目(No.30871176; No.30971374)

△通讯作者 Tel：021-64041990-2138; E-mail: dxq93216@medmail.com.cn

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