细胞周期素D1、视网膜母细胞瘤样蛋白2及微小染色体维持蛋白7在肝细胞癌中的表达及对预后的意义

刘 娟, 殷 飞, 姚树坤

(1东南大学附属中大医院消化内科, 江苏 南京 210009; 2河北医科大学第四医院消化内科, 河北 石家庄 050011； 3卫生部中日友好医院消化内科, 北京 100029)

细胞周期素D1、视网膜母细胞瘤样蛋白2及微小染色体维持蛋白7在肝细胞癌中的表达及对预后的意义

刘 娟1△, 殷 飞2, 姚树坤3

(1东南大学附属中大医院消化内科, 江苏 南京 210009;2河北医科大学第四医院消化内科, 河北 石家庄 050011；3卫生部中日友好医院消化内科, 北京 100029)

目的研究细胞周期素D1(cyclin D1)、视网膜母细胞瘤样蛋白2(RBL2/p130)及微小染色体维持蛋白7(MCM7)在肝细胞癌(以下简称肝癌)中的表达及对预后诊断的意义。方法用免疫组织化学法检测44例肝癌组织、26例癌旁硬化肝组织及18例正常肝组织中cyclin D1、RBL2/p130及MCM7的表达情况，并分析其与肝癌患者临床参数间的关系。结果肝癌组织中cyclin D1和MCM7的阳性表达率分别是68.2%和72.7%，显著高于正常肝组织及癌旁硬化肝组织(P<0.01)；RBL2/p130的阳性表达率为34.1%，显著低于正常肝组织及癌旁硬化肝组织(P<0.01)，MCM7与cyclin D1的表达呈正相关(r=0.349,P<0.05)，与RBL2/p130的表达呈负相关(r=-0.421,P<0.01)；cyclin D1与RBL2/p130的表达呈负相关(r=-0.435,P<0.01)。Cyclin D1及MCM7的表达与肿瘤包膜的完整性、肿瘤分化程度及肝癌临床分期有关，RBL2/p130的表达与有无门脉癌栓、肿瘤分化程度及肝癌临床分期有关(P<0.05)。MCM7还与肿瘤大小及甲胎蛋白(AFP)值的大小有关。多因素分析显示肿瘤大小、MCM7及cyclin D1与肝癌预后相关(P<0.05)。MCM7及cyclin D1阳性表达的患者、RBL2/p130阴性表达的患者预后差(P<0.05)。结论Cyclin D1、RBL2/p130和MCM7的异常表达在肝癌形成过程中发挥了重要作用。监测其在肝癌中的表达情况将有助于判断肝癌患者的预后。

细胞周期蛋白D1； 视网膜母细胞瘤样蛋白质； 微小染色体维持蛋白质； 肝肿瘤

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，大多数患者就诊时已属晚期，及早对其进行有效干预是改善其疗效的关键。到目前为止，肝癌的发病机制仍不十分明了。近年来对细胞生长调控机制的研究中，DNA复制起始调控在其中的核心作用已被提出。微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance protein，MCM)是真核细胞DNA复制前复合体的重要组成部分，为所有真核细胞DNA复制启动所必需[1]。视网膜母细胞瘤样蛋白2(retinoblastoma-like protein 2，RBL2/p130)是近年来发现的Rb基因家族新成员的表达产物，在细胞周期不同阶段发挥负调控功能，它们的异常表达均会引起细胞周期调控失常从而导致细胞癌变的发生。我们先前的基因芯片研究首次发现MCM7 mRNA及RBL2/p130 mRNA在肝癌组织中差异表达[2],提示复制起始及转录调控异常在肝癌的发生中可能发挥了重要作用，本次研究中，我们利用免疫组化技术在蛋白水平上进一步研究它们在肝癌中的表达状况，进而探讨其临床意义。

材 料 和 方 法

1标本来源及处理

44例原发性肝细胞癌组织、26例癌旁硬化肝组织(肿瘤周边2 cm以外的无癌硬化肝组织)及18例肝血管瘤周边正常肝组织为2005年7月至2008年3月手术切除后经10%中性甲醛固定后石蜡包埋标本。所有肝癌患者(无其它肝病)术前均未进行任何形式的治疗，其中男性37例，女性7例，年龄33-71岁，平均52岁。临床分期按2001年9月中国抗癌协会肝癌专业委员会制定标准对患者进行分期[3]，I期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期17例。所有组织类型均经病理科确诊，并按Edmondson-Steiner分级,其中I-Ⅱ级24例,Ⅲ-IV级20例。所有患者均术后随访至2009年6月。

2免疫组织化学染色石蜡包埋组织切片4 μm厚，常规脱蜡至水，0.3%H2O2室温下15-20 min，以阻断内源性过氧化物酶，充分水洗，在pH 9.0的Tris/EDTA液中高压3 min(MCM7)或在pH 6.5的柠檬酸缓冲液中高压20 min(RBL2/p130及cyclin D1)，进行抗原修复，室温冷却，分别加入按1∶100稀释的浓缩型鼠抗人单克隆抗体MCM7、RBL2/p130或兔抗人多克隆抗体cyclin D1，4 ℃冰箱过夜，此后步骤及显色按二步法试剂盒说明进行，苏木素复染，常规脱水，透明，封片。二步法免疫组化检测试剂盒购自上海基因公司，浓缩型鼠抗人单克隆抗体MCM7、RBL2/p130及浓缩型兔抗人多克隆抗体cyclin D1均购自Neomarker。以不加Ⅰ抗作为阴性对照，以PBS代替Ⅰ抗作为空白对照，用已知阳性片作为阳性对照。

3结果判定

采用双盲法，由2位病理医师独立观察每张切片5个具有代表性的高倍视野，组织切片中胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞标志。根据细胞质或核的染色程度及染色细胞百分率进行分析评分：不着色为0分，着色淡为1分，深者3分。着色细胞占计数细胞百分率<10%为0分，>10%者为阳性表达，10%-30%为1分，31%-60%为2分，>61%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘为其最后得分。

4统计学处理

用SPSS 11.5软件进行统计分析，各项指标与临床参数的关系应用2检验，检测指标间的关联分析采用Spearman相关分析，预后单因素分析采用Kapplan-Meier曲线及log-rank检验，多因素分析采用Cox比例风险模型。

结 果

1CyclinD1、RBL2/p130及MCM7在不同肝组织中的表达

Cyclin D1及RBL2/p130在各组肝组织中均有表达，主要表现为胞核着色。MCM7在癌旁硬化肝组织及正常肝组织中均不表达，在肝癌组织中表现为核着色。

2CyclinD1在肝癌组织中的表达情况与临床参数间的关系

Cyclin D1在肝癌中的阳性表达率为68.2%，显著高于癌旁硬化肝组织及正常肝组织(P<0.01)。其表达水平与患者年龄、性别、有无门脉癌栓、癌灶个数、肿瘤直径、甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)值及乙肝表面抗原阳性与否无关；cyclin D1蛋白在无包膜及包膜不完整的癌组织中的阳性率分别为83.3%、88.2%，均显著高于在包膜完整的癌组织中的阳性率47.6%(P<0.05)；肝癌分期越晚，cyclin D1蛋白的阳性率越高。Ⅲ期癌组织中的阳性率94.1%显著高于I期的45.4%(2=6.21，P<0.05)和Ⅱ期的56.3%(P<0.05)；肝癌的病理分级越高，癌组织中cyclin D1蛋白的阳性表达率越高，Ⅲ级及IV级癌组织中的阳性率为85.0%，显著高于其在I级及Ⅱ级癌组织中的阳性率54.2%(P<0.05),见表1、2、图1。

表1 Cyclin D1、RBL2/p130和MCM7在不同肝组织中的表达

表2 Cyclin D1、RBL2/p130和MCM7的表达与肝癌患者临床参数间的关系

Figure 1. The expression of MCM7, RBL2/p130 and cyclin D1 in different groups.A:the expression of MCM7 in HCC(SP,×400)；B：the expression of MCM7 in normal liver(SP,×200)；C：the expression of RBL2/p130 in HCC(SP,×400)；D：the expression of RBL2/p130 in normal liver(SP,×400)；E：the expression of cyclin D1 in HCC(SP,×400)；F：the expression of cyclin D1 in normal liver(SP,×400).

3RBL2/p130在肝癌中的表达情况及与临床参数间的关系

RBL2/p130在肝癌中的阳性表达率为34.1%，显著低于癌旁硬化肝组织及正常肝组织(P<0.01)。其表达率与有无门脉癌栓、肿瘤分化程度及肝癌临床分期有关，与患者年龄、性别、癌灶个数、肿瘤大小、肿瘤包膜完整与否、AFP值的大小及乙肝表面抗原阳性与否无关,见表1、2、图1。

4MCM7在肝癌组织中的表达情况及与临床参数间的关系

MCM7在肝癌组织中的阳性表达率是72.7%，其表达水平与患者年龄、性别、有无门脉癌栓、癌灶个数及乙肝表面抗原阳性与否无关；与AFP值、肿瘤直径、肿瘤包膜完整性、临床分期及病理分级有关,见表2、图1。

5单因素预后分析结果

应用Kaplan-Meier法对HCC患者累积生存曲线进行log-rank检验，结果显示cyclin D1表达阳性的患者累计生存率显著低于阴性患者(P<0.01)。MCM7表达阳性患者累计生存率显著低于阴性患者(P<0.01)，RBL2/p130阳性患者累计生存率显著高于阴性患者(P<0.05)，见图2-4。

6CyclinD1、RBL2/p130及MCM7间的相关性及多因素分析结果

Cyclin D1与MCM7在肝癌中的表达呈正相关(r=0.349,P<0.05)，二者与RBL2/p130的表达呈负相关(分别为r=-0.435、r=-0.421,P<0.01)。多因素分析显示：肿瘤直径(P<0.05)、MCM7(P<0.05)及cyclin D1(P<0.05)是影响肝癌预后的独立因素,见表3、4。

Figure 2. The relationship between MCM7 expression and HCC prognosis.

Figure 3. The relationship between RBL2/p130 expression and HCC prognosis.

Figure 4. The relationship between cyclin D1 expression and HCC prognosis

表3 MCM7的表达与RBL2/p130、cyclin D1间的关系

表4 影响肝癌预后的多因素分析

讨 论

Cyclin D1是一种反应细胞周期变化的蛋白，在正常细胞周期中，cyclin D1与CDK4形成复合物cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，从而失去抑制转录因子E2F的活性，解除Rb调控G1期停滞作用，启动DNA合成，使细胞周期从G1期进入S期，促进细胞增殖。cyclin D1过度表达可缩短细胞周期G1/S期转换时间,增加细胞周期转换速度,导致细胞增殖失控而癌变[4]。研究表明cyclin D1在多种肿瘤中过度表达，并与肿瘤的发生发展关系密切[5]。Patil等[6]研究认为cyclin D1的高表达在c-Met和β-catenin诱发的肝癌产生中发挥了促进作用。本次研究证实，肝癌组织中cyclin D1阳性表达率显著高于癌旁硬化肝组织及正常肝组织，并且其表达水平在肿瘤分化程度越低，临床分期越晚的患者中越高，并且，cyclin D1阳性表达的肝癌患者预后差。这些均提示cyyclin D1的过度表达在HCC的发生、发展中发挥着重要的作用。

RBL2/p130，是视网膜母细胞瘤易感基因家族的3个产物之一， RBL2/p130是一个典型的抑癌基因，通过阻断E2F转录调节因子家族的活性，使许多参与细胞周期的基因在G0期处于转录静止状态，在细胞周期中发挥着负性调控的作用。目前，有关p130在肝癌中的表达情况的研究结果并不一致。Huynh[7]研究发现肝癌组织中p130蛋白表达较正常组织升高，认为是机体对肿瘤难以控制的增殖的一种保护性反应；而Claudio等[8]研究认为p130在肝癌组织中表达下调，并且其表达水平与肿瘤的恶性程度呈负相关。本研究结果显示，p130在肝癌中的表达水平明显低于癌旁硬化肝组织及正常肝组织，有门脉癌栓者、肝癌组织分化程度越差、肝癌患者临床分期越晚，其表达水平越低。并且，RBL2/p130阴性表达的肝癌患者预后差。这些结果均提示，RBL2/p130的失活促进了肝细胞的恶性增殖及转移。

MCM是一个保守的蛋白家族，MCM2-7复合物在真核细胞的复制起始和延伸中发挥着重要的作用。MCM2-7与DNA复制起始点结合，与其后几种被募集的起始因子共同组装成复制前起始复合物，这一复合物“准许”染色质开始复制。并且，MCM4/6/7二聚体复合体有解螺旋酶活性和ATP水解活性，能够使双链DNA解链，使复制得以延伸。在复制起始后，MCM2-7则从染色质中解离，在复制期间不再装配前复制复合物以确保每个细胞周期DNA复制的起始和延伸只发生1次。正常细胞中MCM蛋白的mRNA水平随着细胞周期的变化而改变，MCM蛋白的表达在G1/S转换达峰值，当细胞进入G0期和分化、衰老时，MCM表达的水平下降甚至不能检测出[9]。近年来研究发现，MCM蛋白在多种肿瘤组织中表达上调，并与肿瘤细胞的增殖状态、预后有关[10]。Iizuka等[11]研究认为MCM7等受c-myc调节的基因在C基因型乙型病毒性肝炎所致肝癌中高水平表达，并且与肝癌的发生有关。我们前期研究发现MCM家族中MCM7在肝癌组织中高表达[2]，此次进一步研究发现MCM7蛋白仅在肝癌组织中表达，在正常肝组织及癌旁硬化肝组织中均不表达。随着临床分期的增加、组织分化程度的降低、瘤组织包膜的不完整性及肿瘤直径的增加，MCM7的表达水平也更高。而且，在AFP<400 μg/L的肝癌患者中MCM7的阳性率仍可达到56.5%，显示出MCM7具有较AFP更高的肝癌特异性。并且，MCM7阳性表达的肝癌患者预后差。这些均提示MCM7 与肝癌的增殖状态和预后密切相关。

从以上情况可以看出，cyclin D1、RBL2/p130和MCM7在肝癌组织中均异常表达，它们的活化或失活在细胞周期复制起始阶段促进了肝细胞的恶性增殖。它们之间是否存在内在联系？相关分析发现，肝癌组织中cyclin D1与MCM7的表达情况之间存在着正相关关系，二者的表达水平与RBL2/p130蛋白的表达水平呈负相关。前面提到，RBL2/p130能够调节E2F转录调节因子家族的活性，而E2F是许多与G1/S过渡有关的基因表达所需要的，这些基因之中就包括MCM。研究表明，MCM7与RBL2/p130之间存在相互作用[12]，而具有催化活性的cyclin D1/CDK4能与复制前复合物中的MCM7特异性的结合，通过磷酸化Rb来促使其与MCM7的分离，使复制起始点的装配得以完成，细胞进入细胞周期，DNA开始复制[13]。然而，在肿瘤中大多数细胞处于细胞周期中，cyclin D1及MCM7的高表达也许仅仅反映了这些细胞正处于G1期，同样，在G0期高表达的RBL2/p130也可以由细胞所处周期解释为什么它在HCC中较低阳性表达率，下一步我们将用Ki67的染色来帮助判断这些细胞是否在细胞周期中。另外，RBL2/p130的基因位点位于16 q，在肝癌中经常缺失，是否突变导致了这3个基因的异常表达仍有待于进一步研究。

综合以上情况，我们认为cyclin D1，RBL2/p130和MCM7的异常表达在肝癌的形成过程中发挥了重要的作用。Cyclin D1、RBL2/p130及MCM7可以作为判断肝癌生物学行为和预后的重要指标。

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ExpressionandprognosticsignificanceofcyclinD1,RBL2/p130andMCM7inhepatocellularcarcinoma

LIU Juan1, YIN Fei2, YAO Shu-kun3

(1DepartmentofGastroenterology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFourthHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China;3DepartmentofGastroenterology,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,China.E-mail:hepatology-2003@163.com)

AIM: To investigate the expression and prognostic significance of cyclin D1, retinoblastoma-like protein 2(RBL2/p130) and minichromosome maintenance protein 7(MCM7) in hepatocellular carcinoma(HCC).METHODSThe expression of cyclin D1, RBL2/p130 and MCM7 in 44 HCC specimens, 26 adjacent noncancerous cirrhotic liver specimens and 18 normal liver specimens were detected by the method of immunohistochemistry. The correlations of cyclin D1, RBL2/p130 and MCM7 with the clinical parameters of HCC patients were analyzed.RESULTSThe positive expression rates of cyclin D1 and MCM7 in HCC were 68.2% and 72.7%, higher than those in normal livers and adjacent noncancerous cirrhotic livers(P<0.01). The positive expression rate of RBL2/p130 in HCC was 34.1%, lower than that in normal livers and adjacent noncancerous cirrhotic livers(P<0.01). The expression of MCM7 in HCC was positively correlated with the expression of cyclin D1(r=0.349,P<0.05), and negatively correlated with the expression of RBL2/p130(r=-0.421,P<0.01). The expression of cyclin D1 in HCC was negatively correlated with the expression of RBL2/p130(r=-0.435,P<0.01). The expression of MCM7 and cyclin D1 was associated with the integrity of tumor capsule, differentiation degree and TNM stage(P<0.05). The expression of MCM7 was also associated with tumor size and the value of alpha fetoprotein(AFP). The tumor size, the expression levels of MCM7 and cyclin D1 were correlated with the prognosis determined by multivariable analysis. The patients with positive expression of MCM7 and cyclin D1 had lower survival rate than those with negative expression(P<0.05). The patients with positive expression of RBL2/p130 had higher survival rate than those with negative expression(P<0.05).CONCLUSIONThe abnormal expression of cyclin D1, RBL2/ p130 and MCM7 plays an important role in the development of HCC, indicating that monitoring their expression in HCC patients may be helpful to the judgment of prognosis.

Cyclin D1; Retinoblastoma-like protein; Minichromosome maintenance protein; Liver neoplasms

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-018

1000-4718(2011)02-0304-06

2010-06-11

2010-12-17

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Tel：025-83272034; E-mail：hepatology-2003@163.com