BCR-ABL-SEA DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答*

高永鹏， 林 晨△， 田红霞， 陈 琛， 秦雅楠， 周羽竝， 李扬秋

(暨南大学医学院1 微生物与免疫学系， 2生物化学系，3血液病研究所， 广东 广州 510632)

BCR-ABL-SEA DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答*

高永鹏1， 林 晨1△， 田红霞1， 陈 琛1， 秦雅楠1， 周羽竝2， 李扬秋3

(暨南大学医学院1微生物与免疫学系，2生物化学系，3血液病研究所， 广东 广州 510632)

目的了解BCR-ABL-SEA双表达DNA疫苗诱导BALB/c小鼠特异性细胞和体液免疫应答效应。方法用已成功构建的重组双表达BCR-ABL 多肽和 SEA多肽的质粒BCR-ABL-pIRES-SEA (B-P-S)免疫小鼠，间隔14 d共3次。相同方法用单表达BCR-ABL 多肽或 SEA多肽的质粒BCR-ABL-pIRES 和SEA-pIRES免疫小鼠作对照。利用CCK-8 比色法检测小鼠脾脏T 细胞对K562细胞株的杀伤活性；流式细胞术测定小鼠脾脏CD4+与CD8+T细胞表达情况；ELISA法检测小鼠血清中干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)生成情况；间接免疫荧光法检测血清中抗BCR-ABL抗体。结果免疫后第7周时，双表达重组质粒B-P-S组小鼠脾脏CTL细胞针对K562杀伤率、血清中INF-γ含量均明显高于单表达BCR-ABL-pIRES组和SEA-pIRES组(P<0.05)；CD4+/CD8+T细胞比值、血清中IL-4含量各组之间无明显差异(P>0.05)；荧光显微镜检测到血清中有抗BCR-ABL抗体。结论所构建的BCR-ABL-SEA重组双表达质粒可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答效应。

白血病； 基因,BCR-ABL融合； 葡萄球菌肠毒素A； 疫苗,DNA

微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)仍然是慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)治疗缓解后复发的一个重要因素,特异性免疫治疗通过免疫监测和清除残留白血病细胞对预防CML复发以及延长生存期有重要作用[1,2]。CML患者具有特征性的BCR-ABL融合基因，研究发现表达BCR-ABL融合基因的细胞及其融合蛋白多肽可以诱导T细胞克隆性增殖，由于单独BCR-ABL多肽免疫原性较弱[3]，因此寻找适合的免疫佐剂是临床应用亟待解决的重大问题。本课题组前期研究已经显示，超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)可以有效增强多肽抗原诱导特异性T细胞克隆[4,5]。DNA疫苗能够同时诱导体液和细胞免疫,而且具备传统疫苗无法比拟的诸多优点而成为新一代最有潜力的疫苗之一[6]。本研究是利用已成功构建的BCR-ABL-pIRES-SEA的真核表达疫苗免疫BALB/c小鼠，进一步分析其体内刺激细胞和体液免疫应答效应，为发展特异性免疫治疗提供研究资料。

材 料 和 方 法

1材料

1.1质粒 本课题组成功构建的BCR-ABL-pIRES-SEA(B-P-S)(专利申请号为201010160423.1)真核双表达重组质粒及SEA-pIRES(S-P)和BCR-ABL-pIRES(B-P)单表达重组质粒[7]。

1.2动物和分组 BALB/c小鼠由中山大学动物实验中心提供(编号为SCXK20040011)，雄性，6-8周，18-22 g。随机分为5组:(1)N组：生理盐水；(2)P组：pIRES质粒；(3)B-P-S组：双表达BCR-ABL-pIRES-SEA质粒；(4)B-P组：单表达BCR-ABL-pIRES质粒；(5)S-P组：单表达SEA-pIRES质粒。各组小鼠分别于第0、2、4周在双侧股四头肌各注射1次，每次注射剂量为200 μg，免疫前1 d同一部位注射1%普鲁卡因40 μL。初次免疫后第7周处死小鼠。

2方法

2.1CTL 杀伤活性实验

① 靶细胞 K562细胞株作为杀伤性实验的靶细胞，培养体系含10%灭活胎牛血清、1×105U/L青-链霉素的RPMI-1640培养基，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱常规培养；NB4细胞株作为杀伤性实验阴性对照，以检测细胞毒作用的特异性。

② 效应细胞 在无菌条件下，取小鼠脾脏置研磨器中加EZ-SepTMmouse 1×小鼠淋巴细胞分离液2 mL共研磨后，细胞悬液移至离心管，离心分离单个核细胞层，计数并用RPMI-1640液调整细胞2×1010cells/L上样至96孔板，加入K562细胞株作为刺激源而进行混合淋巴细胞培养4 h。

③ 按效靶比为40∶1加入靶细胞，于96孔培养板内100 μL/well,微量混合器振荡5 min,以促进效、靶细胞之间接触；同时分别设效应细胞对照组和靶细胞对照组(100 μL/well)。每组均设3个平行孔。各组于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养4 h。继而在各孔内加入10 μL的CCK-8试剂,在培养箱内培养4 h后,以450 nm为检测波长,600 nm 为参考波长,于酶标仪上测定各孔吸光度(A)值。

对靶细胞的杀伤百分率=

2.2流式细胞术检测CD4+/CD8+T 细胞比值 直接免疫荧光染色及流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞比值变化情况。收集各组小鼠诱导培养4 h后的T 细胞,洗涤计数后,待测100 μL细胞悬液分别加入FITC-CD4和PE-CD8标记单抗各5 μL,其中生理盐水组作为阴性对照组,室温避光染色15 min。用洗涤液洗涤2次,加入终浓度2%多聚甲醛固定,流式细胞仪检测,利用MultiSET V 1.1.1软件进行分析。

2.3小鼠血清中IFN-γ和IL-4测定 按试剂盒说明书操作，按1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0 ng/L进行对倍稀释以制作标准曲线。生物素化抗体工作液配制：以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1∶100)。酶结合物工作液配制：以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶100)。取出所需板条，除空白孔，分别将标本或不同浓度标准品(100 μL/well)加入相应孔中，每样品设2复孔，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育90 min,洗板4次。除空白孔外，每孔加入生物素化抗体工作液100 μL。用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育60 min,洗板4次。除空白孔外，每孔加入酶结合物工作液100 μL。封住板孔37 ℃孵箱孵育30 min。洗板4次。加入显色剂100 μL/well，避光37 ℃孵箱孵育10-15 min,加入终止液100 μL/well，混匀后即刻在450 nm酶标仪测定标本的吸光度A450值(5 min内)。

2.4间接免疫荧光检测血清中抗BCR-ABL抗体 收集对数生长期的K562细胞，PBS洗涤2次，1 500 r/min离心3 min，去上清调整细胞浓度约1×109cells/L，分别加入各组小鼠血清作为Ⅰ抗，以生理盐水组作为阴性对照。37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，离心。 加入羊抗鼠FITC标记Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，点片。用荧光显微镜观察并拍照。

3统计学处理

结 果

1免疫小鼠CTL杀伤活性检测

各组小鼠CTL对K562细胞和对照组NB4细胞的杀伤率见表1。对照组NS组和P组两组之间没有明显差别，且组内对2种靶细胞的杀伤率之间也无明显差别(P>0.05)。B-P组对K562细胞杀伤活性高于对照N组,而且也显著高于同组对NB4细胞的杀伤效果(P<0.05)。S-P组不仅可以对K562细胞有杀伤活性，同时对NB4产生明显的杀伤作用，但两者之间的杀伤活性没有显著差异。B-P-S组对K562细胞杀伤活性明显高于B-P组和S-P组，而且杀伤效果高于同组对NB4细胞株的杀伤效果(P<0.05)。此外，与B-P组和S-P组对NB4细胞杀伤活性比较，B-P-S组也对NB4细胞有显著的杀伤活性(P<0.05)。

表1 免疫小鼠CTL针对K562和NB4细胞的杀伤率

2CD4+/CD8+细胞比值变化

对小鼠CD4+、CD8+T细胞亚群的百分比的影响见表2和图2，各组间无明显差异(P>0.05)。但B-P-S组CD4+/CD8+T 细胞比值降低趋势比较明显。

表2 免疫小鼠CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比变化情况

3免疫后小鼠血清中IFN-γ的检测

结果见表3，组间两两比较差异显著(P<0.01)。B-P-S组明显高于质粒B-P组、S-P组(P<0.05)，B-P组有升高但与阴性对照比无明显差异。

表3 免疫后小鼠血清中IFN-γ的含量

4免疫后小鼠血清中IL-4的检测

结果见表4，组间无明显差别(P>0.05)。

表4 免疫后小鼠血清中IL-4的含量

5小鼠血清中抗BCR-ABL抗体的检测

B-P-S组、B-P组K562细胞株表面有绿色的荧光，在其余各组和阴性对照组均未见到荧光，见图2。

Figure 1. The CD4 and CD8 surface markers on the spleen T cells were detected by flow cytometry(FCM) in BALB/c mice after immunization. B-P-S group:BCR-ABL- pIRES-SEA, the reconstructed BCR-ABL- pIRES-SEA plasmids, which were developed previous in our laboratory, were injected into BALB/c mice at 14-d intervals for 3 cycles.The upper left quadrant represents CD8+T cells,while the lower right quadrant is on behalf of CD4+T cells. The CD4/CD8 ratio in B-P-S group was lower than that in negative control group.

Figure 2. The effect of the antibody against target K562 cells in BALB/c mice after immunization(×200).The surface of K562 cells indicates green fluorescence in B-P-S group and B-P group, but not in other groups. A: normal saline group under ordinary microscope; B: normal saline group under fluorescence microscope;C: P(pIRES) group under ordinary microscope; D: P(pIRES) group under fluorescence microscope; E: B-P-S(BCR-ABL-pIRES-SEA) group under ordinary microscope; F: B-P-S(BCR-ABL-pIRES-SEA) group under fluorescence microscope; G: B-P(BCR-ABL-pIRES) group under ordinary microscope; H: B-P(BCR-ABL- pIRES) group under fluorescence microscope; M: S-P(SEA- pIRES) group under ordinary microscope; N: S-P(SEA- pIRES) group under fluorescence microscope.

讨 论

特异性免疫治疗通过诱导机体细胞免疫和体液免疫为清除肿瘤微小残留病灶成为新的治疗手段。DNA疫苗能够在体内有效表达，并同时诱导细胞和体液免疫效应，被抗原提呈细胞摄取后在真核细胞中翻译成蛋白质，以多肽形式与MHC分子结合，并被呈递到细胞表面被T细胞受体所识别，从而特异性激活T细胞引起细胞毒T细胞效应及体液免疫效应[8]。因此有可能成为治疗CML比较理想的治疗方法。

正常情况下，c-ABL蛋白主要存在于细胞的胞核内，与细胞的凋亡有关,而在CML细胞内，BCR-ABL蛋白在细胞内定位紊乱，主要分布于胞质中，发挥着抗凋亡作用。BCR-ABL融合基因是由t(9;22)异常核型形成，其分子生物学本质是9号染色体长臂上的ABL基因易位至22号染色体长臂的断裂点簇集区BCR,形成BCR-ABL融合基因,与CML的发生密切相关。其表达产物融合蛋白是CML发病的分子基础，因此，也是CML患者理想的免疫治疗靶抗原。已有研究表明利用BCR-ABL融合基因构建的DNA疫苗，能够成功在小鼠体内诱导出特异性抗细胞毒性细胞效应，也进一步证明了用BCR-ABL融合基因疫苗治疗CML的可行性[9]。免疫原性弱是目前BCR-ABL融合基因疫苗研究中普遍存在的问题，已有研究显示SEA作为佐剂能够显著增强肽疫苗的免疫原性，可以提高疫苗的治疗效果，我们前期研究也证明了SEA有增强PML-RARα多肽诱导外周血T细胞TCR Vβ亚家族克隆性增殖的能力，并具有增强CTL作用[4，5]。有研究表明将表达细胞因子基因与目的基因一起插入到同一质粒中，由于二者作用的微环境相同，能够进一步增强DNA疫苗的免疫原性[10]，但也发现同一种细胞因子与不同的抗原共同免疫时其作用可能也不同，甚至出现相反作用[11]，而且大多数细胞因子的体内半衰期短，活性容易受内环境影响。因此，鉴于上述DNA疫苗的不足之处，本课题组前期构建了BCR-ABL-SEA的真核双表达质粒，该重组质粒在体外转染真核细胞后，能够在真核细胞中正常地转录，并利用点杂交和SDS-PAGE等检测技术证明了这些重组质粒能够在真核细胞中成功翻译出相应蛋白[7]。本研究在此基础上，进一步将所构建的重组质粒作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，检测其体内抗原特异性抗体和细胞免疫效应。结果表明B-P组在效靶比40∶1条件下，诱导外周血T细胞对CML细胞株K562细胞表现出特异性的杀伤作用。S-P组在同样的条件下也能增强T细胞对2种白血病细胞株的杀伤效应，但缺乏特异性。B-P-S重组双表达质粒在相同条件下，可以诱导出对K562细胞特异性杀伤作用更高的T细胞，这可能是BCR-ABL融合蛋白诱导出特异性的T细胞克隆大量增殖,SEA与优势增殖的特异性T细胞克隆TCR Vβ片段非特异性结合,进一步刺激细胞活化,并产生多种细胞因子,放大所诱导的具有特异性杀伤作用的T细胞增殖。

CD4+Th细胞和CD8+Tc在免疫应答中发挥着其各自作用，因此,T淋巴细胞亚群的数量和相对比值的变化，可以成为衡量机体免疫状态的重要指标。本实验中经疫苗诱导后，对各组小鼠CD4+T和CD8+T 细胞亚群比例的检测均没有发现有明显改变(表2)，提示SEA具有同时活化CD4+T和CD8+T 细胞作用[12]。但本实验B-P-S组诱导T 淋巴细胞活化增殖结果显示，CD4+/CD8+T 细胞比值降低趋势最为明显，是否存在诱导后CD8+T细胞活化增殖能力更强一些？这值得进一步研究证实。机体抗肿瘤效应十分复杂，细胞免疫机制在机体抗肿瘤效应机制中发挥极为重要的作用。肿瘤抗原特异性CD4+T细胞活化后，可分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ和TNF等细胞因子。我们以IFN-γ水平间接反映Th1活化增殖情况，IL-4水平反映Th2活化增殖情况。IFN-γ主要由CD4+Th1细胞和CD8+T细胞所产生，能够诱导单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞等MHC-Ⅱ类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程。增强抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)与T细胞的相互作用，进而增强T细胞辅助抗体和细胞毒T细胞产生的能力，IFN-γ也诱导某些肿瘤细胞表达MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ类分子的作用，增强细胞毒T细胞杀伤靶细胞的能力，同时，还具有巨噬细胞激活因子(macrophage activating factor, MAF)的作用，能引发巨噬细胞的杀肿瘤效应。而IL-4属于Th2细胞产生的特征性细胞因子，主要是促进体液免疫，增强特异性和非特异性的杀伤功能[13]。它能增强B细胞对T细胞的抗原提呈作用，增加B细胞与T细胞的相互作用，促进体液免疫应答。同时能诱导NK细胞、巨噬细胞增殖，促进其提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能。本实验结果显示：B-P-S重组表达质粒诱导Th1作用更加明显。各组小鼠血清中IL-4含量虽然没有表现出明显差异，但B-P-S组仍是最高。B-P-S组、B-P组小鼠血清中还是发现有抗BCR-ABL抗体。机体抗肿瘤免疫应答中，体液免疫应答与细胞免疫机制相互协调和补充，共同执行免疫监视功能，具体调节机制涉及多种因素，相互形成网络共同作用产生最终效应。

综上，本研究表明所构建的BCR-ABL-pRIES-SEA双表达重组质粒能在小鼠体内诱导产生细胞免疫反应和体液免疫反应，而且较单表达BCR-ABL-pRIES质粒的效果要好，初步评价该DNA疫苗具有一定的保护效力。DNA疫苗已经成为新一代最有前景的疫苗之一，如何增强DNA疫苗的免疫原性是DNA疫苗领域亟待解决的问题, 另外，重组质粒注射的剂量以及免疫途径，也影响免疫的效果。本结果为进一步研制出更安全、更有效的预防性疫苗，提供了可行性数据资料。

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ImmuneresponsesinducedbyDNAvaccineofBCR-ABL-SEAinBALB/cmice

GAO Yong-peng1, LIN Chen1, TIAN Hong-xia1, CHEN Chen1, QIN Ya-nan1, ZHOU Yu-bing2, LI Yang-qiu3

(1DepartmentofMicrobiologyandImmunology,2DepartmentofBiochemistry,3InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlinc@jnu.edu.cn)

AIM: To evaluate the immune responses induced by a DNA vaccine expressing both BCR-ABL and SEA peptides in mice.METHODSThe vaccine plasmid of BCR-ABL-pIRES-SEA, which expressed both BCR-ABL and SEA peptides and was constructed previously in our laboratory, was intramuscularly injected into BALB/c mice at 14-day intervals for 3 cycles. The plasmids of BCR-ABL-pIRES and SEA-pIRES, which were only expressed either BCR/ABL peptide or SEA peptide, were also used in the same procedure for comparison. The cytotoxicity of T-cells from mouse spleen against K562 cell line was examined by cell counting kit-8(CCK-8). The ratio of CD4+to CD8+on the harvested T cells was detected by flow cytometry. The serum levels of interferon-γ(IFN-γ) and interleukin 4(IL-4) were measured by ELISA. The antibodies against BCR-ABL were detected by the technique of immunofluorescence.RESULTSSeven weeks after immunization, the specific cytotoxicity of T-cells against K562 cells and the level of INF-γ in co-expression of BCR-ABL-pIRES-SEA group were significantly higher than those in mono-expression of BCR-ABL-pIRES group and SEA-pIRES group(P<0.05). The ratio of CD4+to CD8+on the harvested T-cells and the level of IL-4 in vaccinated mouse serum were not significantly different among the groups(P>0.05). The specific antibody against BCR-ABL was detected in BCR-ABL-pIRES-SEA group and BCR-ABL-pIRES group but not in SEA-pIRES group by indirect immunofluorescene analysis.CONCLUSIONThe recombinant BCR-ABL-pIRES-SEA vaccine induces specific humoral and cellular immune responsesinvivo.

Leukemia; Genes, BCR-ABL fusion; Staphylococcal enterotoxin A; Vaccines,DNA

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-028

1000-4718(2011)02-0361-06

2010-07-12

2010-11-30

广东省自然科学基金资助项目(No.06025169)；广州市科技支撑计划资助项目(No.2009Z1-E161)

△通讯作者 Tel：020-85220257；E-mail: tlinc@jnu.edu.cn