分辨魔角旋转核磁共振波谱在大鼠慢性胰腺炎分级中的应用

田冰 陆建平 马超 杨根金 黄文才 汪剑 蒋斐 苏晓菊 王小玮

·论著·

分辨魔角旋转核磁共振波谱在大鼠慢性胰腺炎分级中的应用

田冰 陆建平 马超 杨根金 黄文才 汪剑 蒋斐 苏晓菊 王小玮

目的观察大鼠实验性慢性胰腺炎(CP)进展过程中胰腺组织代谢产物变化特征，探讨其在CP分级中的价值。方法Wistar大鼠36只，经尾静脉注入二丁基二氯化物(dibutyltin dichloride,DBTC)溶液8 mg/kg体重制备CP模型。注射后即刻(对照组)及7、14、21、28、35 d分批取大鼠胰腺组织，小部分行病理检查，大部分液氮冷冻后置-80℃保存。应用高分辨魔角旋转核磁共振波谱(HR-MAS NMR)法检测胰腺组织的代谢产物。以非正常结构、管状复合物、腺体萎缩、纤维化、水肿及炎细胞浸润程度等作为基本指标进行病理分级。结果胰腺组织的病理损伤严重程度随造模时间的推移逐渐增加，造模后7、14 d大鼠胰腺改变为轻度CP，造模后21、28、35 d大鼠胰腺病理改变为重度CP。重度CP大鼠胰腺组织中甜菜碱(Bet)、胆碱(Cho)化合物含量较轻度CP组及对照组大鼠明显增多，而天冬氨酸盐(Asp)、乳酸(Lac)、脂肪酸(FA)、异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸(Ile/Leu/Val)的含量明显减少。轻度CP与对照组大鼠胰腺组织的代谢产物含量无明显差异。结论应用HR-MAS NMR分析胰腺组织代谢产物有助于区分重度CP与轻度CP。

胰腺炎，慢性; 魔角旋转; 核磁共振波谱学; 代谢

慢性胰腺炎(CP)是临床较为常见的消化系统疾病之一。目前采用的CP分级标准多基于临床表现、实验室检查及影像学表现等[1],缺乏从代谢层面对CP不同病程阶段的代谢特征进行分析。高分辨魔角旋转核磁共振波谱(high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopy，HR-MAS NMR)是一种无创的离体组织代谢成分的分析方法[2]，具有较高的灵敏度，可以较准确地分析组织内各类化合物。本研究应用HR-MAS NMR分析CP大鼠不同时期的代谢特征变化，探究HR-MAS NMR在大鼠CP分级中的价值。

材料与方法

一、大鼠CP模型的建立

雄性Wistar大鼠36只，由第二军医大学实验动物中心提供，体重约为250 g。采用经尾静脉注入二丁基二氧化物溶液200 μl(8 mg/kg 体重)[3]方法造模，造模后即刻(对照)及7、14、21、28、35 d分批开腹，小心剥离胰腺，大体观察胰腺外形，然后将小部分胰腺置福尔马林液固定，大部分胰腺置液氮保存。

二、胰腺病理学检查

固定的CP胰腺组织常规病理切片，HE染色，由2位资深病理学专家采用双盲法镜下观察，并参照文献[4]标准评定炎症分级。

三、HR-MAS NMR分析

BRUKER AVANCE-600谱仪由第二军医大学药学院提供。取CP胰腺组织中间部分约15 mg，氘水清洗后装入4 mm附带球形内腔的ZrO2样品管进行NMR实验，1H共振频率为600.13 MHz。测试用探头为HR/MAS探头，魔角旋转速度为5 KHz，测试温度为300.0 K，实验谱宽为12.02 KHz，采样次数160，恢复时间2 s，采样时间2.5 s，一维1H谱采用预饱和法压制水峰的CPMG脉冲序列，总回波时间180 ms，回波次数30，组织内的大分子及一些短自旋-自旋弛豫时间(T2)代谢物的质子信号被压制。结合二维1H-1H COSY，1H-1H TOCSY实验结果对主要代谢物的谱峰进行指认。

利用BRUKER公司Topspin3.0程序对实验数据进行傅立叶变换，并进行相应的相位及基线校正。一维质子CPMG实验数据用1.31ppm处的脂肪峰进行定标(fat acid,FA)，取0.5～4.6 ppm范围。利用附带的AMIX 软件进行降维简化处理，即对实验数据组进行主成分(principal component analysis, PCA)处理，获得积分(scores)图和与积分图相对应的负载(loadings)图，分析胰腺内代谢物的差异，并用Topspin3.0程序计算典型代谢物在CPMG谱图中对应的积分面积。

结 果

一、胰腺病理形态学改变及分级

造模后2 d内大鼠死亡1只(7 d组)。对照组大鼠胰腺组织呈粉红色，质地均匀细腻，胰管纤细可见；造模后7、14 d组大鼠胰腺轻度水肿，胰管轻度扩张；造模21 d后各组大鼠胰腺明显水肿，胰管明显扩张，并逐渐出现萎缩，表面欠规则。镜下见对照组大鼠胰腺无明显异常；7、14 d组大鼠胰腺组织内中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞浸润，腺泡细胞肿胀、散在点状坏死，间质见少量纤维组织沉积，为轻度CP；21 d后各组大鼠胰腺组织内炎性细胞大量浸润，大量纤维结缔组织增生，胰腺小叶结构破坏，为重度CP。各组均未见明确的管状复合物出现(图1)。

图1对照组(a)、轻度CP组(b)及重度CP组(c)胰腺组织病理改变(HE ×200)

二、HR-MAS NMR分析结果

对照组、轻度及重度CP组的HR-MAS NMR见图2，化学位移为0.7～4.6 ppm，脉冲序列为CPMG。积分图显示，重度CP数据点较为紧密，且与轻度CP及对照组数据分离有明显差异，而轻度CP与对照组间差异不明显。由负载图(图3)显示造成差异的主要代谢物甜菜碱(Bet)，磷酸胆碱/甘油磷酸胆碱(PC/GPC),天冬氨酸盐(Asp)，乳酸(Lac),脂肪酸(FA)及异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸(Ile/Leu/Val)。各组不同代谢产物积分面积(表1)显示重度CP组大鼠胰腺代谢物中Bet、PC/GPC、胆碱(Cho)含量较对照组明显增多，而Asp、Lac、FA、Ile/Leu/Val的含量明显减少。

图2 大鼠正常胰腺和CP胰腺离体组织HR-MAS NMR波谱

图3 胰腺组织的积分图(左)与相应的负载图(右)

CP是由多种原因造成的胰腺局部、阶段或弥漫性炎症。影像学检查在CP诊断、分级、疗效评估等方面起着非常重要的作用。磁共振波谱分析(MRS)是一种基于核磁共振现象和化学位移作用对非特定的原子核及化合物进行分析的一种方法，能够无创地对在体器官、组织进行化合物定量分析。随着MRS技术的迅速发展，高场强MRI-MRS一体化装置的问世和MRS灵敏度的不断提高，MRS无论在临床诊断，还是实验室研究都得到越来越多的应用。目前临床应用的1.5T或3.0T磁共振成像仪可以直接对胰腺组织及病变组织进行MRS分析，但由于磁场强度较低，空间分辩率较低，易受腹腔其他脏器、呼吸伪影及运动伪影峰干扰，所获得的代谢物信息较少。Cho等[5]的研究结果只发现一个有差异的特征性代谢产物。HR-MAS NMR可以不对样品进行任何物理或化学处理。如果条件合适，可以把手术切除的标本直接用于HR-MAS检测，而且使用样品体积少(10～20 mg)，能100%地置于检测线圈内，磁化率均匀，灵敏度很高，近年来在生物医学领域得到广泛应用[6]。

尾静脉注射二丁基二氯化物诱导的大鼠CP以进展性纤维组织沉积为主要特征，与人类CP病程极为相似[3]。本实验结果显示，重度CP大鼠的胰腺组织代谢物与对照组及轻度CP大鼠差异较大，其中Bet、PC/GPC、Cho代谢物含量明显增多，而Asp、Lac、FA、Ile/Leu/Val的含量明显减少。Bet是Cho的产物，作为一种高效的甲基供体，参与细胞内的甲基转移，胆碱化合物主要包括Cho、PC、GPC，是细胞膜磷脂代谢的主要成分，参与细胞膜的合成与降解。Lac与糖酵解密切相关，Ile/Leu/Val属于支链氨基酸，人体不能合成，必须从外界摄取。重度CP时，胰腺实质坏死伴发炎性反应，继而各种炎性因子释放并激活胰腺星状细胞，使之转化为成纤维细胞，后者增殖并合成细胞外基质，导致胆碱化合物及Cho的产物Bet明显增加[7]。

表1 各组大鼠离体胰腺组织不同代谢产物的积分面积

[1] Schneider A,Lohr JM,Singer MV. The M-ANNHEIM classification of chronic pancreatitis: introduction of a unifying classification system based on a review of previous classifications of the disease. J Gastroenterol,2007,42:101-119.

[2] Chen JH,Sambola EB,Kennealey PT,et al.Water suppression without signal loss in HR-MAS 1H NMR of cells and tissues.J Magn Reson,2004,171:143-150.

[3] 何新红,陆建平,廖专,等.二丁基二氯化物尾静脉注射建立大鼠慢性胰腺炎模型.胰腺病学，2007,7:17-20.

[4] van Westerloo DJ,Floquin S,de Bore AM, et al.Therapeutic effects of troglitazone in experimental chronic pancreatitis in mice. Am J Pathol,2005,166:721-728.

[5] Cho SG,Lee DH,Lee KY,et al.Differentiation of chronic focal pancreatitis from pancreatic carcinoma by in vivo proton magnetic resonance spectroscopy.J Comput Assist Tomogr,2005,29:163-169.

[6] Prati D,Shiffman ML,Diago M,et al.Viral and metabolic factors influencing alanine aminotransferase activity in patients with chronic hepatitis C.J Hepatol,2006,44:679-685.

[7] 张汝玲，王兴鹏.慢性胰腺炎胰腺纤维化发生机制及抗纤维化治疗进展.胰腺病学，2001,1：56-58.

2011-01-17)

(本文编辑：吕芳萍)

High-resolutionmagicanglespinningnuclearmagneticresonancespectroscopicinthegradingofchronicpancreatitisinrats

TIANBing,LUJian-ping,MAChao,YANGGen-jin,HUANGWen-cai,WANGJian,JIANGFei,SUXiao-ju,WANGXiao-wei.

DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China

LUJian-ping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

ObjectiveTo observe the metabolic characteristics of an experimental model of chronic pancreatitis, and to investigate its role in the grading of chronic pancreatitis.MethodsThirty-six Wistar rats were injected with dibutyltin chloride (DBTC) solution (8mg/kg) via the tail vein to establish the experimental model of chronic pancreatitis. The 36 rats were divided into 6 groups with 6 rats in each group. On 0, 7, 14, 21, 28, 35 days after modeling, rats was sacrificed and pancreatic tissue of the rats was harvested, and a small part was used for pathologic study, the majority part was kept at -80℃ under liquid nitrogen freezing. Metabolites of pancreatic tissue were determined by high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopic (HR-MAS NMRS). On the basis of the abnormal structure, tubular complexes, gland atrophy, fibrosis, edema and inflammatory cell infiltration, chronic pancreatitis was graded.ResultsPathologic study showed the severity of chronic pancreatitis gradually increased with time after modeling. The 7th, 14th day after modeling, the pancreatic change was mild chronic pancreatitis; the 21st, 28th, 35th day, the pancreatic change was changed into severe chronic pancreatitis. Principal component analysis of HR-MAS NMRS showed that the betaine (Bet) and choline (Cho)-contained components were significantly increased in severe chronic pancreatitis; while aspartate (Asp), lactate (Lac), isoleucine/leucine/valine (I/L/V) and fatty acid (FA) were significantly reduced when compared with those in mild chronic pancreatitis and normal pancreatic tissue. There was no significant difference in the amount of metabolic characteristics between mild chronic pancreatitis and normal pancreatic tissue.ConclusionsHR-MAS NMRS was helpful in distinguishing the severe chronic pancreatitis from mild chronic pancreatitis.

Pancreatitis, chronic; Magic angle spinning; Magnet resonance spectroscopy; Metabolism

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.011

国家自然科学基金(30870709)

200433 上海，第二军医大学长海医院医学影像科(田冰、陆建平、马超、黄文才、汪剑)，消化内科(蒋斐、苏晓菊、王小玮)；第二军医大学药学院分析测试中心(杨根金)

陆建平，Email:cjr.lujianping@vip.163.com