JNK信号通路在急性坏死性胰腺炎大鼠相关性肺损伤中的作用

石亮亮 刘明东 朱浩 陈敏 邹晓平

·论著·

JNK信号通路在急性坏死性胰腺炎大鼠相关性肺损伤中的作用

石亮亮 刘明东 朱浩 陈敏 邹晓平

目的探讨JNK信号通路在重症急性胰腺炎相关性肺损伤中的作用。方法24只大鼠按数字表法随机分为假手术组和急性坏死性胰腺炎(ANP)组，采用胆总管逆行注射5%牛磺胆酸钠建立ANP大鼠模型。制模后12、24 h处死大鼠，取胰腺、肺组织行常规病理检查；采用ELISA法检测肺组织TNF-α和IL-1β含量；实时PCR和蛋白质印迹法检测肺组织JNK mRNA和蛋白的表达。结果ANP组大鼠胰腺组织出血、坏死，大量炎细胞浸润；肺组织水肿，肺实变、间质水肿，炎症细胞浸润。ANP组24 h时肺组织TNF-α、IL-1β含量及JNK mRNA、JNK蛋白、磷酸化JNK表达量分别为(374.3±124.0)pg/ml、(649.0±114.9)pg/ml、2.57±0.76、1.40±0.81、0.81±0.20，均较假手术组的(218.2±68.4)pg/ml、(524.3±58.4)pg/ml、1.03±0.11、0.32±0.11、0.32±0.11显著增加(P值均<0.05)。结论JNK信号通路在实验性ANP相关肺损伤中起着一定作用。

胰腺炎，急性坏死性； 肺损伤； JNK丝裂原活化蛋白激酶类

急性胰腺炎是临床常见的内科疾病，其中重症急性胰腺炎(SAP)约占20%，其病程凶险，常伴有全身炎症反应综合征和多器官功能不全[1]，其中急性胰腺炎相关性肺损伤(acute pancreatitis-associated lung injury，APALI)最为常见，是SAP患者早期病死的最主要的原因[2]。本研究旨在探讨c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)在APALI发生中的作用。

材料与方法

一、实验动物及分组

雄性SD大鼠(200～250 g)24只，清洁级，购自南京鼓楼医院实验动物中心。适应性饲养1周后按数字表法随机分为急性坏死性胰腺炎(ANP)组和假手术组，各12只。大鼠术前禁食12 h，自由饮水。给予氯胺酮腹腔注射麻醉(120 mg/ kg)，采用5%牛磺胆酸钠1. 0 ml/kg体重剂量十二指肠乳头逆行注入胆胰管的方法建立大鼠ANP模型。假手术组大鼠开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次后关腹。术后12、24 h分批处死大鼠，取血及胰腺、肺组织。

二、检测指标

1．胰腺、肺组织病理学检查：取大鼠胰腺组织和右侧部分肺叶置于10%中性甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋、切片、HE染色、显微镜下观察。

2．肺组织TNF-α和IL-1β含量测定：取部分右肺组织制成5%的匀浆液，-20℃保存。用ELISA方法测定肺组织匀浆液的TNF-α和IL-1β含量，按试剂盒(美国Bender公司)说明书操作。

3．肺组织JNK mRNA检测：采用实时PCR方法检测。以Trizol试剂抽提肺组织总RNA，分光光度计检测RNA纯度及浓度。应用逆转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA。JNK上游引物5′-ATTTGG-AGGAGCGAACTAAG-3′，下游引物5′-ATTGAC-AGACGGCGAAGA-3′，扩增片段112 bp；内参β-actin上游引物5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′，下游引物5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′，扩增片段134 bp，引物由Invitrogen公司合成。在ABI PRISM 7500荧光实时定量PCR仪上行扩增反应。反应条件： 95℃ 10 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，45个循环；溶解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每个样本重复3次，取Ct的平均值，采用相对定量2-△△Ct法计算mRNA表达量。

4．JNK和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白检测：采用蛋白质印迹法检测。取肺组织，剪碎后按100 mg组织加0.5 ml RIPA裂解液比例制备组织匀浆，离心取上清，常规行蛋白质印迹法，最后ECL发光，X线片曝光、显影、定影、扫描。以GAPDH蛋白作为内参。用Quantity One软件分析，目标条带与内参条带的灰度比值表示蛋白相对表达量。

三、统计学方法

结 果

一、胰腺、肺组织病理学改变

假手术组大鼠胰腺、肺组织结构正常。ANP组12 h时胰腺腺泡间隙明显扩大，小叶结构破坏，胰腺内出现片状坏死，大量中性粒细胞浸润；24 h时胰腺坏死区域进一步扩大，中性粒细胞浸润相对减轻。ANP组12 h时可见肺组织实性变和部分囊泡样变，间质毛细血管充血、淤血，大量中性粒细胞浸润；24 h时肺组织实变更严重(图1)。

图1ANP组12 h时胰腺(a)及肺组织(b)的病理改变(HE ×100)

二、肺组织TNF-α、IL-1β含量的变化

ANP组肺组织中TNF-α及IL-1β随时间延长而增加，其中TNF-α在12 h时就较假手术组显著升高，IL-1β在24 h时才较假手术组显著升高(P值均<0.05，表1)。

三、肺组织JNK mRNA表达的变化

ANP组肺组织JNK mRNA的表达较假手术组显著增加(P<0.05，表1)。

四、JNK和p-JNK蛋白表达的变化

ANP组JNK及p-JNK蛋白的表达均较假手术组显著升高(P值均<0.05)，其中12 h时p-JNK升高较24 h更明显(P<0.05，表1)。

表1 两组TNF-α、IL-1β含量及JNK、JNK mRNA表达的变化

注：与假手术组同时点比较，aP<0.05；与ANP 24 h组比较，bP<0.05

讨 论

急性胰腺炎并发的急性肺损伤的发病机制至今尚未完全阐明，现在较为公认的是“二次打击”学说，认为过度炎症反应激活效应细胞并释放炎性介质在其中起了重要作用。中性粒细胞可以产生多种炎性介质、氧自由基、蛋白水解酶等毒性物质，其中TNF-α和IL-1是最重要的细胞因子。IL-1是细胞因子网络中最早释放的炎性介质之一，细胞毒性很强，而且可促发细胞因子网络“瀑布效应”，引起严重的组织细胞损伤。TNF-α作为重要的始发因子作用于多种细胞，激发一系列级联反应诱导IL-1、IL-6、IL-8等基因表达，TNF-α还可作用于中性粒细胞促进自身的产生，使炎症瀑布反应放大，增强其破坏作用[3]。本实验结果显示， ANP大鼠肺组织可见大量中性粒细胞浸润，同时肺组织中TNF-α和IL-1β含量增加，证实了炎症因子在肺损伤中的重要作用。

文献报道，NF-κB和环氧合酶-2对这些细胞因子具有调控作用，在APALI的发病中起着重要的作用[4-5]。但是人们用相应拮抗剂治疗，只能部分缓解APALI的病理损伤程度，降低细胞因子的水平，并不能完全改善APALI的病理损伤，这就说明在APALI的发病过程中还存在其他机制。丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)是介导细胞外信号引起细胞内反应的信号转导系统，是调节产生细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β等)、黏附分子(如ICAM-1等)和趋化因子的主要信号转导通路。JNK是MAPKs家族的重要成员之一[6]，在缺血再灌注肺损伤中起着重要作用[7]。本结果显示，ANP组大鼠肺组织JNK mRNA和蛋白表达增加，p-JNK表达也增加，提示在APALI过程中JNK信号通路被激活。

由此可见，ANP并发肺损伤时，炎症因子TNF-α、IL-1β的表达增加，导致JNK信号通路激活，从而激活下游通路，促进炎症因子的产生，引发“瀑布效应”。因此，通过阻断JNK通路的激活，可以抑制炎症反应的扩大。

[1] Chan YC,Leung PS.Acute pancreatitis:animal models and recent advances in basic research.Pancreas,2007,34:1-14.

[2] Bumbasirevie V, Radenkovic D, Jankovic Z, et al.Severe acute pancreatitis: overall and early versus late mortality in intensive care units.Pancreas,2009,38:122-125.

[3] Ertel W, Morrison MH, Wang P, et al.The complex pattern of cytokines in sepsis.Association between protaglandins,cachectin,and interleukins.Ann Surg,1991,214:141.

[4] Ethridge RT, Hashimoto K, Chung DH, et al.Selective inhibition of NF-kappaB attenuates the severity of cerulein-induced acute pancreatitis. J Am Coll Surg,2002,195:497-505.

[5] Song AM,Bhagat L,Singh VP,et al.Inhibition of cyclooxygenase-2 ameliorates the severity of pancreatitis and associated lung injury.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,283:G1166-1174.

[6] Tateda K, Deng JC, Moore TA, et al.Hyperoxia mediates acute lung injury and increased lethality in murine legionella pneumonia:the role of apoptosis.J Immunol,2003,170:4209-4216.

[7] Ishii M, Suzuki Y, Takeshita K, et al. Inhibition of c-Jun NH2-terminal kinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs.J Immunol, 2004,15,172:2569-2577.

2010-11-12)

(本文编辑：吕芳萍)

JNKsignalpathwayinacutenecrotizingpancreatitisassociatedlunginjuryinrats

SHILiang-liang,LIUMing-dong,ZHUHao,CHENMin,ZOUXiao-ping.

Departmentofgastroenterology,DrumTowerHospital,MedicalSchool,NanjingUniversity,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of JNK signal pathway in acute necrotizing pancreatitis(ANP) associated lung injury.MethodsA total of 24 SD rats were randomly divided into sham group and ANP group, ANP rats were induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into common bile duct. The rats were sacrificed 12 and 24h later, and the pancreas and lung tissue were resected and underwent routine pathologic examination, ELISA method was used to detect the level of TNF-α and IL-1β in lung tissue. Expression of JNK mRNA was detected by real time PCR, and the expression of JNK protein were evaluated by Western blotting.ResultsThere was bleeding, necrosis, large amount of inflammatory cells infiltration in pancreatic tissue; and there was edema, pulmonary consolidation, interstitial edema, inflammatory cells infiltration in lung tissue in ANP group. The levels of TNF-α and IL-1β, JNK mRNA, JNK protein, phosphorylation JNK were (374.3±124.0)pg/ml, (649.0±114.9)pg/ml, 2.57±0.76, 1.40±0.81, 0.81±0.20 in ANP group, which were significantly higher than those in with sham group [(218.2±68.4)pg/ml, (524.3±58.4)pg/ml, 1.03±0.11, 0.32±0.11, 0.32±0.11,P<0.05].ConclusionsJNK signal pathway plays an important role in experimental ANP associated lung injury in rats.

Pancreatitis, acute necrotizing; Lung injury; JNK mitogen-activated protein kinases

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.010

210008 南京，南京大学医学院附属鼓楼医院消化科

邹晓平，Email：zouxiaoping795@hotmail.com