急性胰腺炎大鼠血清蛋白质组学分析

余开焕 任俊 黄运涛 陈辰 宋湧

·论著·

急性胰腺炎大鼠血清蛋白质组学分析

余开焕 任俊 黄运涛 陈辰 宋湧

目的分析急性水肿型胰腺炎(AEP)和急性坏死型胰腺炎(ANP)大鼠血清蛋白质表达的差异，寻找判断AP病情的血清指标。方法采用4%或5%牛磺胆酸钠逆行注入胆胰管法分别制备AEP和ANP大鼠模型。应用血清蛋白质谱弱阳离子交换芯片(WCX2)，采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术分析AEP和ANP大鼠血清蛋白质谱的差异。结果AEP和ANP大鼠血清蛋白质在质荷比为1000～50 000分子量之间有38个蛋白质差异表达(P<0.05)，其中AEP大鼠血清中分子量为9500和9700的两种蛋白质表达明显高于ANP大鼠。结论用SELDI-TOF-MS技术能检测出AEP与ANP大鼠血清蛋白质的差异表达。分子量9500和9700蛋白质的表达下降可能是AEP向ANP转化的征兆。

胰腺炎； 蛋白质组学； 血清； 质谱法

临床上将急性胰腺炎(AP)分为轻症急性胰腺炎(MAP)和重症急性胰腺炎(SAP)。MAP在病理学上表现为急性水肿性胰腺炎(AEP)，而SAP则多表现为急性坏死性胰腺炎(ANP)。本研究制备大鼠的AEP及ANP模型，应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术分析AEP与ANP大鼠血清蛋白质谱表达的差异，寻找判断AEP进展为ANP的血清标志物。

材料和方法

一、动物模型制作及分组

雄性Wistar大鼠30只，体重250 g左右，购自武汉大学人民医院动物实验中心。按数字表法随机分为对照组、AEP组和ANP组，每组10只。参照Aho造模方法[1]，采用4%或5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)以1 ml/kg体重的剂量逆行注入胆胰管分别制备AEP和ANP模型。对照组只接受剖腹术，胰管不注入任何液体。12 h后从大鼠心脏取血，离心取血清，部分血清用于淀粉酶的检测，其余置-80℃冰箱待用；取大鼠胰腺，常规病理检查，并依据Shmidt标准[2]评分。

二、血清蛋白谱检测

1．血清样本准备： 4℃下融解冰冻血清，每个样品取10 μl，加入20 μl U9缓冲液(9 mol/L尿素，2%CHAPS，50 mmol/L Tris-HCL，pH9.0)，4℃下400 r/min振荡30 min，然后向30 μl稀释样品中加入50 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)370 μl混匀。

2．芯片预处理、上样和洗脱：弱阳离子交换芯片(WCX2)购于Ciphergen公司。将WCX2芯片装入生物芯片处理器，每孔加入200 μl 醋酸钠缓冲液，400 r/min振荡5 min，甩掉缓冲液，重复2次。芯片处理器每孔加入100 μl 样品，4℃ 400 r/min振荡1 h。甩出样品，每孔加入200 μl醋酸钠缓冲液，室温下400 r/min振荡5 min，重复2次。每孔加入200 μl HPLC水，立刻甩出，重复1次。取出芯片，待干后每个加样孔上加SPA(50% CAN+0.5% TFA)0.5 μl，重复1次，待干后上机测定。

3．芯片的检测和结果分析：先设定仪器主要参数，激光强度175，检测灵敏度6，优化分子量范围1000～20 000，最高为50 000。收集样品点数为100次。数据收集分子量范围1000～50 000，先用信噪比(s/n)>5和>2各过滤一次。筛出的质荷比峰在10%以上的样本中同时存在，且同一质荷比峰在不同样本中的偏差<0.3%，以去除原始数据中的噪声。经上述数据处理后，用Ciphergen proteinchip3.1自动采集数据，计算机根据所获得的原始数据快速精确地绘制出蛋白质质谱图，纵坐标为波峰强度，即蛋白质相对含量，横坐标为质荷比(M/Z)，即蛋白质相对分子量。然后用Biomarker Wizard软件进行数据比较和Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、模型的判定

对照组、AEP组和ANP组大鼠血清淀粉酶水平分别为(882±106)、(2174±320)、(4757±556)U/L，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。AEP组大鼠胰腺组织的水肿、腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎症细胞浸润4项病理评分分别为3.5±0.3、0、0.5±0.2、3.4±0.6；ANP组分别为3.8±0.5、3.7±0.2、3.6±0.6、3.6±0.5，其中ANP组的腺泡坏死、出血和脂肪坏死的分值明显高于AEP组(P<0.05)。表明模型制作成功。

二、AEP与ANP大鼠血清差异表达的蛋白

经SELDI-TOF-MS技术分析比较AEP组和ANP组的血清蛋白质，一共检测到138个蛋白质峰，其中38个蛋白质含量差异有统计学意义(P<0.05)，AEP大鼠9500和9700的蛋白质表达明显高于ANP大鼠(图1)。

图1 ANP组(上)和AEP组(下)血清蛋白质谱

临床上常采用Ranson评分[3]、APACHEⅡ标准[4]、Balthazar CT[5]评分判断AP病情的严重程度，但均有一定的局限性。许多学者正在寻找可靠、快捷的血清学指标，其中C-反应蛋白有一定价值，但其血清浓度在发病48 h后才达到高峰[6-8]，因此寻找更加简捷、有效的血清学指标来判定SAP仍然十分必要。

AP在其发病过程中，体内蛋白质也会发生相应的改变。SELDI-TOF-MS技术作为较新的蛋白质组学研究方法，具有快速、高通量、高敏感性、重复性好的优点。将它与正常对照或某种疾病的图谱，甚至基因库中的图谱进行对照，即能发现和捕获新的特异性相关蛋白质[9]。在临床上，MAP多表现为AEP， SAP多表现为ANP。因此，通过比较AEP与ANP状态下血清蛋白质表达差异，可能为该技术临床应用于判定MAP和SAP提供实验基础和理论依据。本研究制备AEP和ANP大鼠模型，经SELDI-TOF-MS检测分析，AEP和ANP大鼠血清中有38个表达差异的蛋白质，其中9500和9700分子量的蛋白质表达差异最为明显，说明这两者表达下降可能是AEP向ANP转化的征兆，同时两者相连，可能是同一蛋白质因如磷酸化和脱磷酸化[10-11]而导致结构变化表现的不同表达状态。为此，我们下一步将对临床上MAP和SAP患者的血清予以验证，进一步分析这两种蛋白的临床实用价值。

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2010-11-02)

(本文编辑：吕芳萍)

Serumproteomicanalysisofacutepancreatitisinrats

YUKai-huan,RENJun,HUANGYun-tao,CHENChen,SONGYong.

DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

RENJun,Email:renjun0414@163.com

ObjectiveTo investigate the difference of the protein expression in serum of rats with acute edematous pancreatitis (AEP) and acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate serum marker for acute pancreatitis severity.MethodsThe model of AEP and ANP was induced by retrograde injection of 4% or 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Weak cation exchange (WCX2) and surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (SELDI TOF MS) was used to investigate the difference of the protein expression in serum of rats with AEP and ANP.ResultsThirty-eight spectral peak clusters which had significantly different signal intensities between AEP and ANP sera at mass charge ratio between 1000-50 000(P<0.05) were detected. The peak clusters at 9500 and 9700 in the sera of AEP were higher than that in ANP rats.ConclusionsSerum analysis with SELDI-TOF MS can detect the difference of the protein expression in rats with AEP and ANP. The decreased expression of the protein of molecular weight of 9500 and 9700 may be a signal of AEP transition into ANP.

Pancreatitis; Proteomics; Serum; Mass spectrometry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.008

湖北省自然科学基金(131349)

430060 湖北武汉，武汉大学人民医院普外科

任俊，Email:renjun0414@163.com