在线样品预处理限进色谱测定人血清中多奈哌齐浓度

马 骏，樊鹏程，任 俊，贾正平

(兰州军区兰州总医院药剂科，甘肃 兰州 730050)

·药物不良反应及个案报告·

在线样品预处理限进色谱测定人血清中多奈哌齐浓度

马 骏，樊鹏程，任 俊，贾正平

(兰州军区兰州总医院药剂科，甘肃 兰州 730050)

目的通过在线样品预处理限进色谱柱切换技术建立一种测定人体血清中多奈哌齐血药浓度的高效液相色谱法。方法样品预处理采用LiChroCART (25 mm × 4 mm，25 μm) 限进预柱，分析柱为Microsorb-MV C18柱 (150 mm × 4.6 mm，4 μm )，以水-乙腈 (99:1, v/v) 为血浆蛋白冲洗流动相，流速2 ml/min，0.02 M 磷酸缓冲液-乙腈-三乙胺 (65:35:0.1， v/v/v) 为分析流动相，流速1 ml/min，检测波长315 nm。结果本方法线性范围为0.02～1.0 μg/ml，r=0.999 5，日内、日间精密度RSD小于7%，回收率为87.9%～91.1%。结论该方法准确、稳定；灵敏度高，适用于多奈哌齐药物动力学及生物利用度的研究。

限进填料；在线样品预处理；多奈哌齐；柱切换

多奈哌齐(donepezil)为中枢选择性胆碱酯酶抑制剂。对于阿茨海默病人认知损伤及记忆力衰退治疗均有效，其抑制平台的血浆药物浓度超过0.05 μg/ml，因此多奈哌齐血药浓度可作为提示其治疗阿茨海默病人疗效的参考指标[1]。已有血浆中多奈哌齐测定的报道，但其多数使用了液液萃取技术[2～4]，血样预处理及待测物浓缩往往包含了冗长繁杂的过程。

在线样品预处理柱切换系统被认为是对于传统的样品预处理技术的改进，它避免了繁琐的手工处理过程，缩短了样品预处理时间从而缩短了分析时间，提高了回收率。该过程可以通过柱切换技术实现。基于此目的，限进填料(restricted access material，RAM)色谱预柱近年来常常被用于生物样品基质中化合物快速分析领域[5～14]。该填料能够简化样品处理过程，加快样品处理步骤，实现样品处理自动化。

RAM柱填料有着亲水性外表面以及疏水性内表面。生物基质中的大分子，主要是蛋白质，由于其亲水性而被流动相很快冲出，不被固定相保留。小分子化合物则能够同疏水内表面发生相互作用而被保留。其后用强度高的流动相将小分子化合物冲至分析柱进行分离分析[11]。烷基二醇(alkyl-diol-silica，ADS)填料已成为目前最为流行的RAM填料。ADS填料孔径为6 nm，其性质由其内表面键合的不同基团(C4, C8or C18等)决定[5]。ADS预柱的总进样寿命为血浆体积80～100 ml[12]。

本实验建立了一种简便、快速在线样品预处理HPLC柱切换系统测定血清中多奈哌齐的方法，该系统串联了ADS预柱和C18分析柱，本方法分析时间短，为治疗药物监测和药动学实验提供分析方法。

1 材料和方法

1.1仪器与试药 在线样品预处理系统由岛津LC-6A泵作为蛋白质冲洗泵，串联Waters 600泵，后者为分析泵，Waters 996 PDA 紫外可见光检测器；TGL-16G高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)；PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；AS5150超声发生器(上海医用分析仪器厂)。

多奈哌齐对照品由南京泽众药业有限公司提供；正常人血清由兰州总医院血液中心提供；色谱级乙腈由禹王药业 (山东)提供；其他化学试剂均为分析醇；水为二次蒸馏水。

1.2色谱条件 LiChroCART (25 mm×4 mm, 5 μm) 预柱由Lichrospher ADS色谱硅胶填料填充(25 μm)，连接Rheodyne 7000 六通高压切换阀；分析柱为Microsorb-MV C18柱(150 mm×4.6 mm, 4 μm)[7]；Rheodyne 7725 进样阀；Catati 100 μl进样环。

蛋白洗脱流动相为水-乙腈(99:1，v/v)，分析流动相由0.02 M磷酸盐缓冲液(pH 4.6)-乙腈-三乙胺(65:35:0.1,v/v/v)组成。流动相均通过0.45 μm尼龙微孔滤膜，氦气在线脱气，柱温为室温，分析流动相流速为1.0 ml/min，分析周期为16 min。在该色谱条件下，多奈哌齐的保留时间为11.3 min。进样体积为100 μl，为了降低血清杂质的影响检测波长设为315 nm。

1.3样品在线处理与切换阀切换时间及样品分析过程 见表1。

表1 柱切换系统分析过程

注： A-水-乙腈 (99:1, v/v)； B-0.02 M 磷酸缓冲液-乙腈-三乙胺 (65:35:0.1, v/v/v)；C- 水-乙腈 (90:10, v/v)。

1.4空白血清预处理 空白人血清-40℃冻存。使用之前，血清样品于37℃水浴复溶，室温下离心(8 000×g)10 min。

2 结果

2.1方法专属性 在上述柱切换系统色谱条件下，对空白血清、空白血清加入对照品的色谱图进行比较。多奈哌齐的保留时间为11.5 min，选择315 nm作为检测波长，血清内源性物质及其他杂质不会干扰样品的分离测定，色谱图如图1-A、B、C。

图1空白血清(A)、0.02μg/ml多奈哌齐(B)和0.1μg/ml多奈哌齐血清色谱图(C)

2.2标准曲线制备及检测限 精密称量多奈哌齐10 mg，甲醇配制成1 mg/ml 储备液，-40℃冻存。多奈哌齐在酸性环境中稳定[15,16]，储备液由0.001 M 盐酸配制成1.5 μg/ml工作液4℃保存[2]。工作液由空白血清稀释至多奈哌齐终浓度为0.02、0.03、0.06、0.10及1.0 μg/ml，制作标准曲线。按“1.3”项下方法进行HPLC分析，以多奈哌齐浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：Y=74.732C-191.833，Y代表峰面积，C代表浓度，r=0.999 5。结果表明血清中多奈哌齐在0.02～1.0 μg/ml 浓度范围内有良好的线性关系。LOQ为20 ng/ml。

2.3回收率及精密度实验 取空白血清，配制多奈哌齐浓度分别为0.02、0.10、1.0 μg/ml的对照品血清数份，按“1.3”项下方法进行HPLC分析，分别计算日内、日间精密度，结果见表2。将测得结果与相应浓度对照品甲醇溶液未经预柱萃取测得结果相比较计算回收率，结果见表2。

表2 多奈哌齐精密度及回收率(n=5)

3 讨论

根据文献[2]向流动相中适当加入一定比例的有机溶剂能使血清蛋白结合的药物由结合位点释放出来。为增加待测物的回收率，实验中流动相A中加入了1%乙睛，并适当延长了萃取时间及转移时间(1.5 min)。对于集成了RAM预柱的柱切换系统，较小比例的一定量的有机溶剂，如乙腈作为调节溶剂加入流动相中，可改善RAM预柱的萃取能力，使得待分析物质由蛋白结合位点释放，以达到较高的回收率[7]。冲洗流动相中乙腈比例的增加可减少多奈哌齐由预柱洗脱至分析柱的时间。实验中发现当乙腈的比例小于5%时未发现多奈哌齐回收率有显著变化，故冲洗流动相A中乙腈的比例最终选择为1%(v/v)，以得到最大回收率。

实验考察了不同流速对血清蛋白冲洗时间的影响，以便选择最佳流速及柱切换时间。随着流速的增加，血清蛋白洗脱时间缩短，但2 ml/min与3 ml/min的差别并不显著，故选择了2 ml/min作为蛋白冲洗流速，以减少分析时间且维持萃取效率。对于柱切换阀切换时间的选择，在流速为2 ml/min 条件下，5.5 min即可完全冲洗完全血清中的蛋白杂质，多奈哌齐在20 min内不会被洗脱，而在切换流动相洗脱时1 min内可被洗脱至分析柱。故选择5.5 min作为切换时间。

本实验通过限进色谱填料预柱在线样品预处理系统，建立了一种简单、快速、高选择性的基于柱切换系统的在线人血清多奈哌齐测定方法。由于血清中多奈哌齐浓度较低故柱切换在线萃取富集技术非常适用。此外，由于限进色谱填料的应用，样品预处理过程具有高度选择性，多奈哌齐在长波长范围(315 nm)得到了较好测定。同已有的生物样品中多奈哌齐测定方法相比，本实验显著降低了萃取及分离的时间，且回收率较高，线性关系良好，精密度、准确度符合要求。已报道的多奈哌齐分析条件较为苛刻，需要调节pH至2，并加入高氯酸，可能对色谱柱产生负面影响[2]。本实验分析条件易于实现，对分析柱无影响，简化了已报道的柱切换系统[16]。该方法有较好的线性关系，精密度及回收率，可用于生物样品中多奈哌齐的常规分析及生物等效性研究。

[1] Rogers SL, Farlow MR, Doody RS,etal. A 24-week, double-blind, placebo-controlled trial of donepezll in patients with Alzheimer 's disease[J]. Neurology, 1998, 50: 136.

[2] Norio YF, Furuya R, Takahata T,etal. Determination of donepezil, an acetylcholinesterase inhibitor, in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection[J]. J Chromatogr B, 2002, 768: 261.

[3] Radwan MA, Abdine HH, Al-Quadeb BT,etal. Stereoselective HPLC assay of donepezil enantiomers with UV detection and its application to pharmacokinetics in rats[J]. J Chromatogr B, 2006, 830: 114.

[4] Nakashima K, Itoh K, Kono M,etal. Determination of donepezil hydrochloride in human and rat plasma, blood and brain microdialysates by HPLC with a short C30 column[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 41:201.

[5] Souverain S, Rudaz S, Veuthey JL,etal. Restricted access materials and large particle supports for on-line sample preparation: an attractive approach for biological fluids analysis[J]. J Chromatogr B, 2004, 801:141.

[6] Chiap P, Piette M, Evrard B,etal. Automated method for the determination of a new matrix metalloproteinase inhibitor in ovine plasma and serum by coupling of restricted access material for on-line sample clean-up to liquid chromatography[J]. J Chromatogr B, 2005, 817:109.

[7] Rbeida O, Chiap P, Lubda D,etal. Development and validation of a fully automated LC method for the determination of cloxacillin in human plasma using anion exchange restricted access material for sample clean-up[J]. J Pharm Biomed Anal, 2005, 36: 961.

[8] Vintiloiu A, Mullett WM, Papp R,etal. Combining restricted access material (RAM) and turbulent flow for the rapid on-line extraction of the cyclooxygenase-2 inhibitor rofecoxib in plasma samples[J]. J Chromatogr A, 2005, 1082:150.

[9] Musteata FM, Walles M, Pawliszyn J. Fast assay of angiotensin 1 from whole blood by cation-exchange restricted-access solid-phase microextraction[J]. Anal Chim Acta, 2005, 537: 231.

[10] Lambert JP, Mullett WM, Kwong E,etal. Stir bar sorptive extraction based on restricted access material for the direct extraction of caffeine and metabolites in biological fluids[J]. J Chromatogr A, 2005, 1075: 43.

[11] Neto AJ, Rodrigues JC, Fernandes C,etal. Automated microcolumn-switching system for drug analysis by direct injection of human plasma[J]. J Chromatogr A, 2006, 1105:71.

[12] Ortelli D, Rudaz S, Souverain S,etal. Restricted access materials for fast analysis of methadone in serum with liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Sep Sci, 2002, 25:222.

[13] 樊鹏程, 马 骏, 贾正平, 等. 在线柱切换RP-HPLC测定人血清中卡马西平浓度[J].药物分析杂志, 2008, 28(12): 2033.

[14] Yamamoto E, Igarashi H, Sato Y,etal. Reliable on-line sample preparation of basic compounds from plasma using a reversed phase restricted access media in column-switching LC[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 42:587.

[15] Pappa H, Farru R, Vilanova PO,etal. A new HPLC method to determine Donepezil hydrochloride in tablets[J]. J Pharm Biomed Anal, 2002, 27:177.

[16] Asakawa Y, Ozawa C, Osada K,etal. Reduction of carry-over in column-switching HPLC/MS system with automated system washing procedure for highly sensitive direct analysis of donepezil in dog plasma[J]. J Pharm Biomed Anal, 2007, 43:683.

2009-12-10

[修回日期] 2010-10-02

Detectionofdonepezilfromserumbyon-linesamplepreparationRAM-HPLC

MA Jun, FAN Peng-cheng, REN Jun, JIA Zheng-ping

(Department of Pharmacy, General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo establish a sample preparation restricted access material (RAM) HPLC method for the quantification of donepezil in human serum.MethodThe sample was prepocessed by LiChrospher®ADS C18(25 mm × 4 mm，25 μm) as pre-column and analyzed by Microsorb-MV C18(150 mm × 4.6 mm，4 μm ) as analytical column. Acetonitrile to water (99:1, v/v) was flushing mobile phase with flow rate of 2 ml/min. The mixture of phosphate buffer (pH 4.6, 0.02 M), acetonitril and triethylamine (65:35:0.1, v/v/v) was analytical mobile phase with flow rate of 1 ml/min. The detection wave was 315 nm.ResultsThe linear range was from 0.02 to 1.0 μg/ml (r=0.999 5). The RSDs of intra-day and inter-day were less than 7%, the recoveries were between 87.9%～91.1%.ConclusionThe method is accurate, stable and sensitive which could be used to study the pharmacodynamics and bioavailabilty of donepezil.

restricted access material; on-line sample preparation; donepezil; column-switching

马 骏(1962-)，男，主任药师.Tel: (0931) 8994656.

贾正平.Tel：(0931) 8994652.

R92;R94

A

1006-0111(2011)02-0122-03