AB-8大孔树脂对甘草提取液的最佳动态纯化条件

高宏 贠亚波 兀江波 曹霞萍

AB-8大孔树脂对甘草提取液的最佳动态纯化条件

高宏 贠亚波 兀江波 曹霞萍

为优选出AB-8型大孔树脂对甘草酸的最佳动态吸附及解吸条件。我们采用正交试验法优选AB-8大孔树脂对甘草提取物的最佳动态吸附工艺，采用单因素实验优选解吸纯化的最佳工艺进行综合分析。通过对数据的直观分析和方差分析得出上柱药液浓度对吸附量有显著影响，最佳上样条件为A3B1C2，即上柱液浓度为0.5 g/ml，径高比为1∶8，流速为2 ml/min为最佳上样条件，采用30%的乙醇洗脱杂质，采用80%的乙醇富集甘草酸。

甘草;甘草酸;正交实验;AB-8大孔吸附树脂

甘草为豆科植物甘草的干燥根和根茎。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的作用;用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性［1］。甘草中含有的主要有效成分为甘草苷、甘草酸等。大孔吸附树脂是20世纪60年代末在离子交换剂和其他吸附剂应用的基础上，人工合成的一种新型多孔性高分子聚合物。其巨大的比表面积使其具有良好的吸附性能，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离提纯的目的。在甘草的有效成分中，甘草酸与甘草酸的含量较多。本实验采用AB-8大孔吸附树脂对从甘草中提取的甘草酸进行进一步纯化研究。

1 仪器与试药

仪器：美国惠普HP1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，HP1100/WIND3D化学工作站;AE-240电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。试药：甘草酸单铵盐对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110731-200513);甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯;AB-8型((南开大学化工厂);甘草购自亳州永刚药材总公司，粉碎(过80目筛)，备用。

2 实验方法和结果

2.1 甘草酸含量测定方法色谱分析条件色谱柱：HP hypersiL C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱温为 30℃;流动相为甲醇-0.2 mol/ml醋酸按-0.1%醋酸(60∶40∶0.1);检测波长250 nm;流速0.8 ml/min;进样体积10 μl。对照品色谱图见图1。

图1 甘草酸单铵标准品图

2.2 对照品溶液的制备 取甘草酸单铵盐对照品5 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，冰箱内保存备用。

2.3 供试品溶液的制备 称取已粉碎的粗粉甘草，置玻璃层析柱中，加入5倍量的0.5%氨水浸泡6 h后，开始渗漉，收集渗漉液12倍量后，停止渗漉，浓缩渗漉液，以备上样。

3 实验方法

3.1 树脂预处理 乙醇湿法装柱，用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇液，至乙醇液与水混合(1：5)不呈白色浑浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇至无醇昧。再用2BV的5%HCL溶液，以4～6 BV/h的流速通过树脂层并浸泡2～4 h，再用蒸馏水以同样流速洗至出水pH呈中性，然后用2 BV的2%NaOH溶液，以4～6 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2～4 h，最后用蒸馏水以同样流速洗至出水pH值呈中性，树脂保存在层析柱中备用，

3.2 动态吸附 为考察上柱条件对树脂吸附的影响，根据预试验结果，确定上柱树脂体积50 ml，以径高比、上样浓度、流速作为考察因素，建立L9(34)正交试验，实验安排见表1、2。以甘草酸到达泄漏点(流出液中目的产物的质量浓度达到进样质量浓度的5%时，即为吸附终点，达到吸附终点时得流出液体积定义为泄漏点［2］)时，树脂柱对甘草酸的吸附总量作为测评指标，确定最佳上样条件。具体操作：按照正交表安排，选定符合规格的层析柱，取AB-8大孔吸附树脂50 ml湿法装柱，按照正交试验表安排实验。每10 ml收集一瓶，标号，每瓶取1 ml，稀释至5 ml，过滤，测定收集液中甘草酸的浓度，出现泄漏点时停止上样。结果见表1、2、3。

表1 L9(34)正交实验因素水平表

表2 L9(34)正交实验方案及结果

4 讨论

4.1 本实验采用正交试验优选出最佳的动态吸附条件，同时采用单因素实验优选最佳解吸条件，不仅提高甘草酸的收率，同时纯度也有所提高。

4.2 本实验中利用了不同浓度的乙醇洗脱物质的不同，采用低浓度洗脱杂质，高浓度洗脱有效成分，使得有效部位的提取成为可能。为中药有效成份、有效部位的提取、纯化、分离及中药复方药物的生产研究的进步起到很大的促进作用。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典.化学工业出版社，2010：80.

［2］陈顺，关延彬.大孔树脂吸附骨碎补总黄酮特性的研究.中国中药杂志，2007，32(8)：750-752.

472000 河南省三门峡市中医院

表3 正交试验方差分析表

注：F0.05(2.2)=19.0

因素 SS f F F0.05显著性A 109998.96 2 21.841 19.00＊＊B 34877.097 2 6.925 19.00 C 1588.281 2 1.000 19.00 5036.44 2 0.522 19.00 D(误差)

通过对以上数据的直观分析和方差分析可以看出，影响吸附量的因素主次顺序为 A＞B＞C，最佳上样条件为A3B1C2D2，即当上样浓度为18 mg/ml，径高比为1∶8，流速为2 ml/min为最佳上样条件。按照最优条件重复上样3次，计算对甘草酸的吸附量。结果如表4。

表4 验证实验

709.15 702.65 710.46 1 2 3甘草酸吸附量(mg)实验编号

验证实验表明，优选出的吸附工艺稳定可靠。由此可以计算出1 ml水饱和的AB-8大孔吸附树脂可以吸附14.15 mg甘草酸。

3.3 动态解吸 按照动态吸附的最佳条件准备7根已达达最大上样量的柱子，先用蒸馏水2 ml/min洗脱至洗脱液无色，然后分别用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%以2 ml/min的速度，每25 ml收集为一瓶，过滤后，进行HPLC检测洗脱液中甘草酸的浓度，绘制动态解吸图。见图2。

图2 动态解吸图

由图表可知，20%、30%的乙醇洗脱出来的甘草酸的浓度很小，洗脱液颜色由深变浅在75～150 ml时颜色变化不明显，说明低浓度的乙醇可以洗脱大量的杂质;而80%的乙醇解吸较快且洗脱剂用量较少，在175 ml时已经将甘草酸完全洗脱下来。综合考虑，确定动态解吸先用水洗脱至无色后，用30%的乙醇75 ml洗脱杂质，然后用150 ml80%乙醇洗脱有效成分。

3.4 验证实验 按照最佳动态吸附条件和最佳解吸条件进行验证实验，结果表明，该工艺稳定可行。结果见表5。

表5 纯化验证试验

实验编号 收率 转移率 纯度1 3.25% 77% 69.13%2 3.18% 78% 69.16%3 3.50% 78% 68.69%