HPLC-ELSD法测定苏氨酸中脯氨酸的含量

周浩 黄鑫 吴秀兰 蒋波 吴俗

苏氨酸是一种重要的营养强化剂，有恢复人体疲劳，促进生长发育，保护细胞膜，促进磷脂合成和脂肪酸氧化，抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一种，同时又是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素的原料，苏氨酸中常见杂质为脯氨酸，中国药典2010版中使用TLC法[1]，对杂质脯氨酸进行限量，但无法定量，本文建立苏氨酸中脯氨酸的定量方法，经验证，专属性好，灵敏度高，重复性好，准确度高。

1 仪器与试药

WATERS e2695泵;Alltech蒸发光散射检测器2000ES;苏氨酸(正大天晴，批号:1001011、1001012、1001021);脯氨酸对照品(AR，进口分装，批号100328，惠兴生化试剂)。

2 方法与结果

2.1 专用溶剂 25%乙腈水溶液

2.2 供试品溶液 取苏氨酸50 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加专用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 对照品溶液 取脯氨酸对照品适量，精密称定，加专用溶剂溶解并稀释并制成每1 ml分别含10、20、30、40和50 μg的溶液，即得。

2.4 色谱条件 色谱柱Sepax HP-Silica(250 mm×4.6 mm，5 μm)，40℃;流动相水-异丙醇-正己烷-冰醋酸-三乙胺(200∶750∶50∶6∶0.6)，1.0 ml/min，蒸发光检测器(载气 2 L/min，漂移管 95℃)。

2.5 专属性 配制含苏氨酸5 mg/ml和脯氨酸20 μg/ml的混合溶液，进样，结果脯氨酸和苏氨酸有效分离，专用溶剂无干扰(见图1)。

图1 混合溶液色谱图(下)和专用溶剂色谱图(上)

2.6 线性关系 精密量取各对照品溶液20 μl，分别检测，结果脯氨酸浓度在10～50 μg/ml范围内的浓度对数值(X)与峰响应值对数值(Y)呈显著线性关系，线性方程 Y=1.5224X+7.2756，r=0.9981。

2.7 系统精密度 精密量取对照品溶液(20 μg/ml)20 μl，连续测定6次，结果RSD=1.8%，表明系统精密度良好。

2.8 定量限及检测限 取对照品溶液(10 μg/ml)，逐级稀释，分别测定，当信噪比约10∶1和3∶1时，分别计算定量限和检测限，结果脯氨酸的定量限为5 μg/ml，检测限为2 μg/ml。

2.9 方法重复性 取样品(批号:201001021)，制备5份供试品溶液，分别测定，结果RSD=1.2%，表明重复性良好。

2.10 回收率 取样品(1001011批)约25 mg，精密称定，加入对照品溶液(50 μg/ml)2.0 ml，置10 ml量瓶中，溶解并稀释至刻度，共制备6份，分别测定，结果平均回收率99.2%，RSD=2.2%，表明回收率良好。

2.11 样品测定 取苏氨酸(批号为1001011、1021012和1001021)，分别测定，结果3批中脯氨酸含量分别为0.40%、0.20%和0.00%。

3 讨论

3.1 氨基酸类一般无明显紫外吸收，检测难度大，目前常见的测定方法有三种[2、3、4]，阳离子交换后柱后衍生、反相色谱分离柱前衍生和氨基酸直接分析仪，成本高，操作繁琐，衍生物不稳定。本法无需衍生，同时解决了无紫外吸收缺点，有一定的应用价值，并且采用了正相柱反相系统，有一定的新颖性。

3.2 根据两成分的分离情况，也可以考虑用此色谱条件开发脯氨酸中苏氨酸的定量方法。

3.3 苏氨酸也是常见药用辅料，可以用此进一步开发制剂中辅料苏氨酸的含量测定方法。

[1]国家药典委员会.ChP(中国药典).2010版.VolⅡ(二部).中国医药科技出版社，2010:323.

[2]丁永胜，牟世芬.氨基酸的分析方法及其应用进展.色谱，2004，(03).

[3]赵晶晶，李宏梁.茚三酮柱后衍生法测定软香酥糕点中氨基酸含量及其营养评价食品科学，2011(09).

[4]尚素芬.PITC柱前衍生反相色谱法和OPA柱后衍生离子交换色谱法测定氨基酸含量的比较.河北大学学报(自然科学版)，1996(02).