响应面法优化红曲霉胞外多糖提取工艺

汪鹏荣 蔡琪敏 崔宇辉 蒋冬花 陈丹凤

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

响应面法优化红曲霉胞外多糖提取工艺

汪鹏荣 蔡琪敏 崔宇辉 蒋冬花 陈丹凤

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

对实验室自行分离得到的紫色红曲霉MP－66发酵液中的胞外多糖提取条件进行优化，以提高胞外多糖的产量。通过单因素试验，研究了乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、发酵滤液pH对红曲霉胞外多糖的得率的影响，并在单因素试验基础上，设计三因素三水平的Box－Behnken中心组合试验及响应面法分析对红曲霉胞外多糖的提取工艺进行优化，建立了二次多项式回归方程的预测模型，结果表明:乙醇沉淀时间为16.5 h，乙醇体积分数为80%，发酵滤液pH为8.05，在此条件下红曲霉胞外多糖得率可达7.40 g/L。

胞外多糖 提取工艺 单因素试验 响应面分析法

红曲霉是一类十分重要的药用真菌，红曲霉发酵制成的中药红曲具有活血化瘀、健脾消食等功效及降脂、降压、降糖和抗肿瘤等作用［1］，在食品、色素、中药等领域也有广泛的应用，随之红曲霉的次级代谢产物也成为研究焦点。近年来，日本、美国、韩国等众多学者专家对红曲进行了广泛而深入的研究，并取得了令人瞩目的成果。

真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的由10个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物，是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖，是当今医药和食品工业共同关注的焦点［2］。己在国内临床应用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、灵芝多糖、猴头菌多糖、银耳多糖等［3］。多糖类物质是红曲霉的一种重要次生代谢产物，已有研究表明红曲多糖具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等多种生物学功能［4－6］。目前国内研究主要是通过发酵条件优化提高红曲霉胞外多糖产量［7－9］，但通过胞外多糖提取条件优化进而提高多糖产量的方法还未见报道。响应面法(Response Surface Method，RSM)是一种优化提取工艺条件的有效方法，已被广泛用于同时存在多因素影响的试验优化［10］，其中在微生物多糖和植物多糖的提取研究中应用得较为广泛［11－14］，但在红曲霉胞外多糖的提取工艺研究方面鲜有报道。本研究在单因素试验的基础上采用响应面法优化红曲霉胞外多糖提取工艺参数，可为后续红曲霉胞外多糖的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫色红曲霉(Monascus purpureus)MP－66分离自浙江温州采集的红曲米。

1.2 培养基

1.2.1 PDA 培养基

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH 自然。

1.2.2 种子培养基

葡萄糖 50 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 1 g，KH2PO41 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL，pH 6.0。

1.2.3 发酵培养基

葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，KH2PO4·3H2O 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，培养基起始 pH 5.5。

施工中严格控制泥浆的密度、粘度、含砂量。造孔过程中，始终保持孔内泥浆面在导墙顶面下30～50cm，以防塌孔。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

用打孔器(直径0.8 cm)分别取30℃培养5 d的平板菌种(5块)接种到种子培养基中(250 mL三角瓶装入50 mL液体培养基)，在30℃下，转速200 r/min的旋转式摇床培养48 h。

1.3.2 发酵培养

将上述种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为 8%，250 mL三角瓶装 100 mL培养液，200 r/min，30 ℃培养96 h。

1.3.3 红曲霉胞外多糖的提取方法［7，15］

将培养96 h的发酵液进行抽滤，发酵滤液定容至100 mL，取发酵滤液20 mL加入80 mL无水乙醇中，在5℃下静置过夜、离心，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚反复冲洗，最后在电热恒温鼓风干燥箱烘干至恒重，称量即为胞外多糖的含量。

1.3.4 多糖提取的单因素试验

按照乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、发酵滤液pH提取红曲霉胞外多糖，试验重复3次，计算平均多糖得率。

1.3.5 响应面优化设计试验

根据单因素试验结果，选择确定乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、发酵滤液pH的3个水平，按Box－Behnken设计三因素三水平的试验，并利用响应面法对红曲霉胞外多糖的提取条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇沉淀时间对红曲霉胞外多糖得率的影响

设定乙醇体积分数为80%，发酵滤液pH 7.0，分别选取乙醇沉淀时间为4、8、12、16、20 h进行单因素试验，测定多糖得率。由图1可知，随着乙醇沉淀时间的增加，胞外多糖得率也随之提高，但是在16 h之后胞外多糖的得率增加不明显，这是因为醇析时间过短，乙醇对多糖的沉降会不充分［16］，当沉淀时间达到16 h时发酵液中的绝大部分多糖均已沉淀出来。因此从时间成本上考虑选取16 h为红曲霉胞外多糖的最宜提取时间。

图1 乙醇沉淀时间对多糖得率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对红曲霉胞外多糖得率的影响

设定乙醇沉淀时间为20 h，发酵滤液pH 7.0，分别取20 mL发酵滤液加入无水乙醇，使乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%进行单因素试验，测定多糖得率。由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，胞外多糖得率明显提高，当乙醇体积分数为80%时多糖产量达到最大值，乙醇体积分数超过80%时多糖得率呈下降趋势。醇沉法提取多糖时，乙醇的体积分数对多糖的提取量影响很大，主要取决于多糖的相对分子质量大小和分子的形状［17］。红曲霉胞外多糖在乙醇体积分数为80%时提取得率最大，叶明等［18］人的研究也证明乙醇体积分数为80%时，黑芝胞外多糖提取得率达到最大值。因此，红曲霉胞外多糖提取的最适乙醇体积分数为80%。

图2 乙醇体积分数对多糖得率的影响

2.1.3 发酵滤液pH对红曲霉胞外多糖得率的影响

设定乙醇体积分数为80%，乙醇沉淀时间为16 h，分别将发酵液 pH 调为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0进行单因素试验。由图3可知，当pH小于8.0时，胞外多糖得率随发酵滤液pH的增加而增加，当pH超过8.0时，多糖得率呈下降趋势。发酵液中多糖的沉淀量在偏碱性条件下提取量较大，这可能与其分子带电荷有关［17］，因此，弱碱性条件(pH 8.0)更有利于红曲霉胞外多糖的提取。

图3 发酵液pH对多糖提取量的影响

2.2 响应面法对红曲霉胞外多糖提取条件的优化

2.2.1 Box－Benhnken试验设计与分析

以红曲霉胞外多糖得率(Y)为响应值进行相应分析试验，Box－Behnken设计每个因素取3个水平，以(－1，0，+1)编码，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值［19］。因素水平如表1所示，表2中12组试验为析因实验，3组为中心试验。15个试验点分别为析因点和零点，其中析因点位自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。

表1 Box－Behnken中心组合试验设计因素和水平

表2 Box－Behnken中心组合设计方案及试验结果

2.2.2 回归方程建立与方差分析

利用Minitab 15软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到红曲霉胞外多糖得率(Y)对乙醇沉淀时间(X1)、乙醇体积分数(X2)和发酵滤液pH(X3)的二次多项回归模型为:

Y=0.200X1－0.250X2+0.275X3－0.521X12－0.071X2

2－1.471X32+0.025X1X2－ 0.575X1X3+0.025X2X3+7.267

表3和表4是对方程的方差和回归分析结果。表3可知，模型的一次项 X1、X2、X3显著，其显著性排序为X3＞X2＞X1即单因素对红曲霉胞外多糖提取得率的影响大小依次是发酵滤液pH、乙醇体积分数、乙醇沉淀时间;二次项X12和X32显著，X22不显著;交互项中X1X3显著，X2X3和X1X2不显著。由表4 可知 FModel=40.34，P ＜0.001，表明二次多元回归模型极显著;P失拟项=0.06 ＞0.05，说明模拟失拟不显著;模型的相关系数R2=0.962，表明方程模型与试验数据有96.2%的符合度，该模型有很高的可信度化，可以用此模型对红曲霉胞外多糖的提取工艺进行分析和预测。

表3 回归分析结果表

表4 方差分析表

2.2.3 红曲霉胞外多糖提取得率的响应面法分析

响应面分析的图形是特定的响应值对应自变量构成的一个三维空间图，可以直观的反映出各自变量对响应值的影响［20］。图5、图6、图7为因素交互作用的响应面和等高线。响应面是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图，因素对试验结果影响越大，表现为曲面越陡峭［21］。等高线的形状，圆形或者椭圆形可以反映出变量之间的相互影响是否显著，圆形表示两因素间交互作用不显著;而椭圆形则显著［22］。从图5、图6、图7中可以看出，3个响应面均为开口向下的凸行曲线，说明响应值(红曲霉胞外多糖得率)存在极大值。

当乙醇体积分数为80%时，乙醇沉淀时间与发酵滤液pH对胞外多糖得率的交互作用见图5。乙醇沉淀时间一定时，随着发酵液pH的增加，胞外多糖产量逐渐增加，在pH 8.0时出现极大值，之后随着pH的增加，胞外多糖得率呈下降趋势;乙醇沉淀时间在12～20 h范围内胞外多糖得率变化不太明显。沿着发酵滤液pH方向的等高线密度比较大，说明滤液pH对胞外多糖得率的影响大于乙醇沉淀时间。

图5 乙醇沉淀时间与发酵滤液pH对胞外多糖得率的响应面图

当发酵滤液pH 8.0时，乙醇沉淀时间与乙醇体积分数对胞外多糖得率的交互作用见图6。由图6可知，乙醇体积分数在70% ～80%范围内，胞外多糖得率随着乙醇体积分数的增大而增加，当乙醇体积分数超过80%时，胞外多糖得率开始下降;乙醇沉淀时间在12～16.5 h范围内时，胞外多糖得率随着沉淀时间的增加而增加，在乙醇沉淀时间为16.5 h时达到最大值。

图6 乙醇沉淀时间与乙醇体积分数对胞外多糖得率的响应面图

当乙醇沉淀时间16 h时，乙醇体积分数与发酵滤液pH对胞外多糖得率的交互作用见图7。由图7可知，当乙醇体积分数与发酵滤液pH分别控制在80%和8.0之内时，胞外多糖得率随着二者浓度的增加而增加，而当任一因素高于其相应浓度时，胞外多糖得率均将无法达到最大值。

图7 乙醇体积分数与发酵滤液pH对胞外多糖得率的响应面图

为确定各因素的最佳取值，在选取的各因素范围内利用Minitab 15软件进行响应优化设计，得出回归模型存在最大值点，Y的最大值为7.47 g/L，此时对应的各因素取值分别为:乙醇沉淀时间为16.5 h，乙醇体积分数为80%，发酵滤液pH 8.05。

2.2.4 试验验证

为了检验模型预测的准确性，采用响应面优化的工艺条件(乙醇沉淀时间为16.5 h，乙醇体积分数为80%，发酵滤液pH 8.05)进行红曲霉胞外多糖提取试验，试验重复3次，所测得的红曲霉胞外多糖得率的平均值为7.40 g/L，与理论最优值(7.47 g/L)仅相差0.94%，可见该模型能较好地预测红曲霉胞外多糖的提取情况，证明此次RSM试验参数准确可靠，具有一定的应用价值。

3 结论

在单因素试验的基础上，考察了乙醇体积分数、乙醇沉淀时间及发酵滤液pH对红曲霉胞外多糖得率的影响。由响应面分析试验得出，乙醇沉淀时间、乙醇体积分数及发酵滤液pH是影响多糖得率的主要因素，其中发酵滤液pH的影响最为显著。依据回归分析确定红曲霉胞外多糖提取的最佳工艺:乙醇沉淀时间为16.5 h，乙醇体积分数为80%，发酵滤液pH 8.05。在此工艺条件下，红曲霉胞外多糖得率可达7.40 g/L。由此可见，通过响应面分析法优化红曲霉胞外多糖的提取工艺条件在实践上是可靠的。

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Optimizing the Extraction Technology of Monascus Exopolysaccharide by Response Surface Methodology

Wang Pengrong Cai Qimin Cui Yuhui Jiang Donghua Chen Danfeng
(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

The extraction conditions for producing exopolysaccharide by Monascus purpureus MP－66 were optimized in order to enhance the extraction yield.Single－factor experiments were carried to investigate the influences of the alcohol volume fraction，the sedimentation time of alcohol，and the pH value of fermentation broth on extraction yield of Monascus exopolysaccharide.On the basis of single － factor experiments，a quadratic polynomial regression equation forecasting model was set up by designing a Box－Behnken central composite experiment involving of three factors and three levels and the method of response surface analysis，thus the optimized extraction conditions for Monascus exopolysaccharide were obtained.According to the results，alcohol sedimentation time was 16.5 h，the alcohol column fraction was 80%，and the pH value of fermentation broth was 8.05.Based on these conditions，the yield of Monascus exopolysaccharide could reach 7.40 g/L.

exopolysaccharide，extraction technology，single factor experiment，response surface methodology

Q939.9

A

1003－0174(2011)12－0083－06

国家自然科学基金(31070008)

2011－01－18

汪鹏荣，男，1986年出生，硕士，应用微生物

蒋冬花，女，1964年出生，教授，微生物学和植物病理学