大蒜素对心室肌细胞膜钠通道电流的影响*

巫少荣, 李自成△, 余 健, 郭 军, 张爱东, 林如波

(1暨南大学附属第一医院心血管内科,广东 广州 510632；2澳门仁伯爵综合医院心内科,中国 澳门)

大蒜素对心室肌细胞膜钠通道电流的影响*

巫少荣1, 李自成1△, 余 健1, 郭 军1, 张爱东1, 林如波2

(1暨南大学附属第一医院心血管内科,广东 广州 510632；2澳门仁伯爵综合医院心内科,中国 澳门)

目的研究大蒜素对心室肌细胞膜钠通道电流(INa)的影响,探讨大蒜素在离子通道水平的药理作用机制。方法用急性酶解法分离大鼠心室肌细胞,应用膜片钳全细胞记录技术,观察不同浓度的大蒜素对钠通道的影响。结果(1)快钠通道电流:大蒜素对豚鼠心室肌细胞INa呈电压依赖性和浓度依赖的抑制作用。(2)大蒜素对INa电流密度-电压关系(I-V)曲线的影响:给药前INa电流密度在膜电位-40 mV达到最大峰值为(-13.41±6.95)pA/pF;在500 μmol/L灌流法给药后,电流密度最大峰值为(-8.53±3.70)pA/pF,给药后电流密度减少约48%。给药前后电流密度变化有显著差异(Plt;0.01)。(3)大蒜素对INa激活-失活曲线的影响:在大蒜素500 μmol/L灌流法给药后,激活曲线显示给药前后半数激活电压为(-44.72±15.61) mVvs(-45.66±17.86)mV，斜率因子为-2.7±0.8vs-2.2±0.7，给药前后变化无显著差异。失活曲线显示大蒜素使失活曲线向负电位方向变化，差异显著;半数失活电压为(-88.61±9.60) mVvs(-103.03±8.90) mV(Plt;0.01)，斜率因子为-7.85±0.88vs-7.55±2.75(Pgt;0.05)。结论大蒜素可浓度依赖性和电压依赖性地抑制心肌细胞膜钠通道电流;给药后I-V曲线上移，显著减少电流密度；其对失活曲线有明显影响，提示大蒜素主要作用于钠通道的失活态。

大蒜素; 膜片钳术; 钠通道; 心室肌细胞

大蒜素(garlicin)是大蒜的有效单体成分，早已发现它具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤和杀虫等作用。近年来发现其还有抗心律失常、抗动脉粥样硬化和降血压等心血管方面作用。其抗心律失常作用的细胞电生理学机制一直未明。本研究应用膜片钳技术观察大蒜素对心肌细胞膜上钠离子通道的作用，以期从心肌细胞离子通道水平明确大蒜素抗心律失常的机制。

材 料 和 方 法

1药物

大蒜素注射液由上海禾丰制药有限公司生产。

2试剂

胶原酶Ⅰ(collagenase I)、氯化胆碱(choline-Cl)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)均为Sigma产品。无钙液(mmol/L)：NaCl 136、KCl 54、MgCl2·6H2O 1、NaH2PO4·2H2O 0.33、HEPES 10、glucose 10，pH 7.4 with KOH。电极内液(mmol/L)：CsCl 100、CsF 110、HEPES 5、NaCl 5、 EGTA 10、MgCl21、Na2-ATP 5，pH 7.2 。细胞外液(mmol/L)：MgCl2.6H2O 1、CaCl20.5、HEPES 10、glucose 10、CsCl 5.4、choline-C l 130、NaCl 5、NaH2PO40.33、CoCl20.5，pH 7.4。

3方法

大鼠处死后,迅速开胸,取出心脏,在4 ℃无钙台氏液中去除脂肪及心包膜后,固定在Langendorff灌流装置上,用无钙液经主动脉逆行灌流,整个灌流过程温度37 ℃,通以95% O2+ 5% CO2混合气,灌流压约70 cmH2O。10 min后转换成用含胶原酶I(0.5 g/L)和牛血清白蛋白(1 g/L)的无钙液灌流,20 min后将心室肌剪下,放入高钾液中吹打得到单个心室肌细胞，保存备用。

3.1膜片钳全细胞记录方法 选取纹理清晰、杆状和大小适中的细胞在室温下进行实验，将适量细胞加入体积约1.5 mL平放于倒置显微镜(Olympus IX 70型)上的细胞池中，贴壁8 min后，用灌流法加药，流速约1.5 mL/min。在电极拉制仪(Narishige PP830型)分2步拉制电极，电阻2-4 MΩ。电极内灌以电极液，置于推进器上，通过三维操纵器(Narishige)驱动电极，并轻压在细胞表面，用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后，用ZAP吸破细胞膜，补偿电容电流及电极串联电阻，形成全细胞模型。信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳AXON 200B放大器放大。实验过程由pCLAMP 7.0 软件程序(Axon)控制，通过AD/DA转换板(AXON DigiData1200)进行刺激发放和信号采集，并存储于计算机硬盘中。

4统计学处理

结 果

1大蒜素对钠通道电流(INa)的影响

电极内液用Cs+代替K+阻断钾电流，电极外液用CoCl2阻断钙电流。细胞钳制电位(holding potential，HP)在-120 mV，施以钳制时间(clamp time，CT)100 ms的指令电位(command potential，CP)从-80 mV到+5 mV的序列除极方波，刺激频率0.5 Hz，步长5 mV，诱发出具有电压依赖性内向钠电流。500 μmol/L大蒜素作用10 min后可见内向钠电流减少，用灌流液冲洗后可恢复部分抑制的钠电流，这可进一步说明内向钠电流减少是大蒜素作用引起的。用钠通道阻断剂3 μmol/L利多卡因可以阻断该电流，可进一步证实所测电流为钠通道电流，见图1。

Figure 1. Effect of garlicin on sodium channel current.A:control; B:garlicin 500 μmol/L; C:post-washing; D:lidocaine 3 μmol/L; E:stimulation square wave.

2大蒜素对钠通道电流作用的量效曲线

用累积加药法，分别观察100、300、750 μmol/L大蒜素对大鼠心室肌细胞INa的影响。结果如图2所示，随着大蒜素浓度增加对INa抑制作用增强。

3大蒜素对INa电流密度-电压关系曲线的影响

以CP为横坐标，其相应INa峰值为纵坐标，绘制电流密度-电压曲线(I-V)，见图3。给药前INa电流密度在膜电位(membrane potential,MP)-40 mV达到最大峰值，为(-13.41±6.95)pA/pF；在500μmol/L大蒜素灌流法给药后，电流密度最大峰值为(-8.53±3.70)pA/pF，给药后电流密度减少约48%。给药前后电流密度变化差异显著(Plt;0.01)。

Figure 2. Dose-effect curve of garlicin for sodium channel current.

Figure 3. Current density-voltage curve of garlicin for INa current density ±s.n=6.Current density (pA/pF)= current intensity/capacitance;MP:membrane potential.

4大蒜素对钠通道激活-失活曲线的影响

以各次条件刺激时测试所得的INa峰值(I)，计算相对电流I/Imax，以CP为横坐标，其相应的I/Imax为纵坐标，绘制激活曲线，见图4。采用双脉冲刺激法，HP为-120 mV，予0.5 Hz、100 ms、-80 mV～ +25 mV的去极化脉冲，在每次条件脉冲后都紧跟以1个固定的80 ms，去极化至-40 mV的测试脉冲，以相对电流I/Imax为纵坐标，CP为横坐标，绘制失活曲线，见图5。失活曲线用Boltzmann方程=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/S]}，(Vm：膜电位；V1/2：半数最大失活电位；S：斜率因子)拟合。

在500 μmol/L大蒜素灌流法给药后，激活曲线显示给药前后半数激活电压为(-44.72±18.61)mVvs(-45.66±17.86)mV,Pgt;0.05;斜率因子为-2.7±0.8vs-2.2±0.7，Pgt;0.05，给药前后变化无显著差异。失活曲线显示：大蒜素使失活曲线向负电位方向变化，差异显著；半数失活电压为(-88.61±9.60)mV vs (-103.03±8.90)mV，Plt;0.01);斜率因子为-7.85±0.88vs-7.55±2.75(Pgt;0.05)。

Figure 4. Active curve of garlicin for sodium channel .±s.n=6. MP：membrane potential.

Figure 5. Inactive curve of garlicin for sodium channel±s.n=5. MP：membrane potential.

讨 论

大蒜属于百合科葱属二年生草本植物，以鳞茎、花茎、嫩叶为主要产品。大蒜中的有效单体成分为大蒜素，其化学结构式为CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2。早已发现它具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤和杀虫等作用[1,2]，近年来发现其还有抗心律失常、抑制平滑肌细胞增殖、抗动脉粥样硬化和降血压等心血管方面作用[3-5]。已有临床实验发现：使用大蒜素注射液可以有效地治疗心律失常，特别是各种期前搏动[6]。动物实验表明大蒜素有抑制心肌收缩、减慢心率等作用。通过离体动物实验模型，有学者研究大蒜素对豚鼠心房肌电生理的作用，发现大蒜素能降低心肌自律性和兴奋性，延长有效不应期[7,8]。国内一些学者[7]还研究大蒜素对豚鼠在体心电图、离体右房自律性及收缩性的影响，发现低浓度(5.25 mg/kg)的大蒜素，最先使心肌Q-T间期延长；中浓度(26.25 mg/kg)的大蒜素，进一步抑制窦性心率及减慢房室传导。由于缺乏对心肌细胞电生理及膜离子通道研究，大蒜素抗心律失常的确切机制目前尚不清楚。在心肌细胞离子通道水平探讨其药理机制，尤其是其对心肌细胞钠离子通道电流及动作电位的影响，目前还未见有研究报道。

钠通道活性与动作电位的形成(0期)有关，是心肌细胞去极化主要的跨膜离子流，影响心肌细胞的兴奋和传导。钠通道阻断剂在心血管系统是作为一类重要的抗心律失常药使用。关于Ⅰ类抗心律失常药物的作用机制，目前普遍易于接受的学说是1977年由Hondgen等[9]提出的受体调节假说(medulated receptor theory)，认为：(1)抗心律失常药物与受体结合后发生作用，该受体位于或非常接近细胞膜离子通道；(2)药物与受体结合、解离与离子通道状况及膜电位有关。离子通道状况包括静息态、激活态、失活态3种状态。钠通道的活性异常影响心肌的传导性和兴奋性，从而产生折返、异常自律性或触发活动，形成各种快速心律失常。所以钠通道已成为许多抗心律失常药物作用的靶点[10,11]。离子通道被药物阻滞后，抑制了心肌细胞的兴奋性和传导性，从而发挥抗心律失常作用。

本实验应用膜片钳全细胞记录技术，观察不同浓度的大蒜素对大鼠心室肌细胞钠通道电流的影响。研究结果表明给药后INaI-V曲线上移，显著减少电流密度；量效曲线显示大蒜素对INa的抑制作用随着浓度的增加而增强，提示大蒜素对钠通道呈浓度依赖性和电压依赖性的阻滞作用; 同时表明大蒜素对INa具有中度的阻滞作用；给药后钠通道激活曲线左移但给药前后变化无显著差异，表明大蒜素对钠通道激活态虽有作用但影响不大。给药后对钠通道失活曲线有明显影响，给药前后变化有显著差异，表明大蒜素对钠通道的激活态及失活态均有影响,但主要作用于钠通道的失活态，由此提示该药物对处于除极状态的病损细胞钠通道亲合力较高，因而该药物对快速型心律失常的疗效可能更为明显。大蒜素对钠通道的阻滞作用是其抗心律失常作用机制的重要组成部分。大蒜素对心肌细胞其它离子通道的影响还需要进一步研究。

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Effectofgarlicinonsodiumchannelcurrentinratventricularmyocytes

WU Shao-rong1, LI Zi-cheng1, YU Jian1, GUO Jun1, ZHANG Ai-dong1,LIN Ru-bo2

(1DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofCardiology,HospitalCondeS.Janurio,Macau,China.E-mail:zichengli@163.net)

AIM: To observe the effect of garlicin on sodium channel(INa) in isolated ventricular myocytes of rats.METHODSThe ventricular myocytes of rats were obtained by enzymatic dissociation and treated with different concentrations of garlicin. The change ofINawas recorded by the technique of whole-cell patch clamp recording.RESULTSGarlicin decreased theINaof isolated ventricular myocytes in a dose- and voltage-dependent manner. The current density was elevated to peak [(-13.41±6.95) pA/pF]under the condition that the membrane voltage was -40 mV before treated with garlicin. The current density was decreased by 48% from peak after treated with 500 μmol/L garlicin [(-8.53±3.70) pA/pF,Plt;0.01]. No significant change of the active curve with the use of garlicin was observed. The median inactive voltages of the inactive curves before and after garlicin treatment were (-88.61±9.60) mV and (-103.03±8.90) mV (Plt;0.01), respectively, and the slopes were -7.85±0.88 and -7.55±2.75 (Pgt;0.05), respectively, indicating that garlicin made a shift to the negative direction.CONCLUSIONGarlicin treatment induced the current density-voltage curve ofINato shift up and significantly decreased the current density. The inactive curve of sodium channel moved to the left, while the current density was not decreased after treated with garlicin. Garlicin blocks sodium channel in its inactive state in a dose- and voltage-dependent manner.

Garlicin; Patch clamp techniques; Sodium channels; Ventricular myocytes

1000-4718(2011)04-0658-04

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.007

2010-11-22

2011-02-10

广东省中医药局科研基金资助项目(No.2009171);暨南大学第一临床医学院重点学科基金资助项目(暨一临【2010】4号)

△通讯作者 Tel: 020-38688620; E-mail：zichengli@163.net