对大豆异黄酮育种评价指标及检测方法的探讨

张永忠 许 晶

(东北农业大学理学院应用化学系1,哈尔滨 150030)

(教育部大豆生物学重点实验室2,哈尔滨 150030)

对大豆异黄酮育种评价指标及检测方法的探讨

张永忠1,2许 晶1

(东北农业大学理学院应用化学系1,哈尔滨 150030)

(教育部大豆生物学重点实验室2,哈尔滨 150030)

大豆异黄酮育种目前采用的评价指标是品种中大豆异黄酮总的含量,采用的检测方法是高效液相色谱法(HPLC)或紫外分光光度法。化学结构决定生物活性,不同化学结构的各种大豆异黄酮单体具有不同的生物活性,生物活性作用的大小也不同。随着科学研究的发展,这个评价指标还需要不断完善,其检测方法也应当能与国际研究接轨,这样将更适合于现代科学研究的发展。简述了大豆异黄酮育种的评价指标及检测方法,建议分别以染料木苷类异黄酮含量和黄豆苷类异黄酮含量作为育种的评价指标,建议采用 AOAC公布的大豆异黄酮的检测方法。

大豆异黄酮 育种 评价指标 AOAC检测方法

大豆异黄酮具有抗乳腺癌和前列腺癌等多种重要的生理功能,所以育种专家们致力于培育富含大豆异黄酮的大豆品种。在培育高含量异黄酮大豆品种研究过程中,首先要确定评价指标和检测方法。目前采用的评价指标是品种中大豆异黄酮总的含量,采用的检测方法是高效液相色谱法(HPLC)或紫外分光光度法[1-2]。化学结构决定生物活性,不同化学结构的各种大豆异黄酮单体具有不同的生物活性,生物活性作用的大小也不同。只以大豆异黄酮总的含量为评价指标,不适应于现代科学研究的发展,所以目前的这个评价指标还需要完善。采用紫外分光光度法只能够测定大豆异黄酮总的含量,不能测定各个单体的含量。采用高效液相色谱法可以测定大豆异黄酮单体的含量,国内就有应用 12种大豆异黄酮标准品进行检测的报道[3],但其检测方法过于繁琐,而 12种大豆异黄酮的标准品在国内是很难购到的,分析检测成本也比较高。即使有了 12种标准品,由于其中部分标准品不稳定,在存放过程中会自动分解而不宜再用。因此,目前的这个评价指标和检测方法都是应当改进和完善的。

1 建议分别以染料木苷类异黄酮和黄豆苷类异黄酮含量作为育种的评价指标

天然存在的大豆异黄酮共有 12种,可以分为 3类,即黄豆苷类 (daidzin groups)、染料木苷类 (genis2 tin groups)和黄豆黄素苷类 (glycitin groups),分别以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷型等 4种形式存在[4-5]。3种游离型的异黄酮苷元包括黄豆苷元 (daidzein)、染料木黄酮(genistein)和黄豆黄素 (glycitein)。这 3种苷元分别与β-D-葡萄糖的苷羟基结合生成 3种葡萄糖苷形式的异黄酮,即黄豆苷 (daidzin)、染料木苷 (genis2 tin)和黄豆黄素苷 (glycitin)。3种葡萄糖苷形式的异黄酮中葡萄糖第 6位的羟基分别与乙酰基结合,则生成了 3种乙酰基葡萄糖苷型异黄酮;3种葡萄糖苷形式的异黄酮中葡萄糖第 6位的羟基分别与丙二酰基结合,则生成了 3种丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮。

国内在大豆异黄酮研究中所用名词术语比较混乱,不够科学、严肃、规范。化学结构决定化合物的性质,也决定生物活性,其名称应能反映出化合物的结构。本文将 genistein译成染料木黄酮[6],这是因为 genistein是大豆异黄酮的苷元,从化学结构上看是黄酮类化合物,化学名称为 5,7,4′-三羟基异黄酮。

染料木黄酮是大豆异黄酮的活性因子。任何物质的宏观性质,主要是由其内在的结构决定的。同样,染料木黄酮之所以被称为植物雌激素,是因为与哺乳动物内源雌激素雌二醇结构相似,具有活性基团二酚羟基,其中染料木黄酮 7,4′两个羟基间的距离几乎等于 17β-雌二醇上 3,17位羟基间的距离。正是由于这种特殊的结构,能够与雌激素靶细胞结合而呈现出一定的雌激素功能。染料木黄酮和17β-雌二醇化学结构见图 1和图 2。染料木黄酮具有多种生物活性和生理功能,美国国家癌症研究所于 1996年已将其列入肿瘤化学预防药物临床发展计划之中,主要预防目标是乳腺癌和前列腺癌[7]。国外研究每一种药品或是生物活性因子,都明确标出其化学结构。如 2008年国外发表的部分研究论文[8-11],所研究的物质都是染料木黄酮。

黄豆苷元也是大豆异黄酮的活性因子。2010年,伯克康奈尔医学研究所、纽约亨特学院生物系、密歇根大学医学院、匹兹堡大学医学院、内穆尔生物医学研究所、罗彻斯特大学、亚拉巴马伯明翰大学、波恩大学 (麻醉科、重症医科)等对黄豆苷元进行了临床试验研究[12],通过精氨酸酶 1启动子调节器的化学筛选,鉴别出大豆异黄酮黄豆苷元可作为一种临床上许可的通过非 cAMP依赖途径来促进神经元的保护和再生作用的小分子。黄豆苷元还可穿过血 -脑屏障,不需经过预处理就能发挥作用[12]。

大豆异黄酮粉是 12种异黄酮的混合物,其中除含有大豆蛋白等普通成分外还含有大豆皂苷 (so2 yasaponin)等生物活性物质,但是应用大豆异黄酮粉进行生物活性试验无法证明究竟是大豆异黄酮粉的活性还是大豆皂苷等化合物的生物活性。科学研究已经证明 12种大豆异黄酮中,染料木黄酮和黄豆苷元具有较高的生物活性[8-12]。染料木黄酮和黄豆苷元存在于豆制品中被人类广泛摄入已有几千年历史。染料木黄酮和黄豆苷元是从含有 2 000种 FDA临床上许可的药物的文库和多种具有人类长期安全食用记录的天然化合物中筛选出来的化合物,所以有望成为安全的药物[12]。因此培育富含染料木黄酮和黄豆苷元的大豆品种将具有重要意义。染料木黄酮和黄豆苷元各自的生物活性作用不同,分别培育出富含染料木黄酮和黄豆苷元的大豆品种可以用来作为制备不同功能的保健食品或是药品的原料。应用这样的原料可以节省染料木黄酮和黄豆苷元分离的成本,对于科学研究和生产实践将更有意义。染料木苷类异黄酮包括染料木苷 (genistin)、乙酰基染料木苷 (6″-O-Acetylgenistin)、丙二酰基染料木苷(6″-O-Malonylgenistin)和染料木黄酮。染料木苷、乙酰基染料木苷和丙二酰基染料木苷经水解后都能生成染料木黄酮。黄豆苷类异黄酮包括黄豆苷(daidzin)、乙酰基黄豆苷 (6″-O-Acetyldaidzin)、丙二酰基黄豆苷 (6″-O-Malonyldaidzin)和黄豆苷元。黄豆苷类异黄酮水解最终产物都是黄豆苷元。建议育种专家分别将染料木苷类异黄酮含量和黄豆苷类异黄酮含量作为育种的评价指标,分别培育出富含染料木苷类异黄酮或黄豆苷类异黄酮的大豆品种。

2 建议采用 AOAC公布的大豆异黄酮检测方法

美国分析化学家协会AOAC(Association ofOffi2 cialAnalytical Chemists)是一个统一的非盈利性科学组织,其在 2001年公布了大豆及大豆食品中异黄酮的测定方法[J.AOAC Int.84,1865(2001)]。

AOAC公布的大豆及大豆食品中异黄酮的测定方法分为提取、皂化和 HPLC检测三个过程。待测试样用甲醇的水溶液 (甲醇 ∶水 =80∶20,体积比)在65℃时提取 2 h。提取物在室温下用氢氧化钠溶液皂化,之后进行酸化,过滤。滤液用甲醇 -水(50∶50,体积比)进行稀释。然后提取物离心澄清并通过液相色谱法进行分析测定。异黄酮葡萄糖苷和苷元在 C18反相柱上以甲醇 -水为流动相进行分离,在紫外 260 nm处检测。结果通过总计异黄酮苷元和相应葡萄糖苷形式的苷元等价物 (均以苷元为单位)的含量表示。

该检测方法并没有应用高档次仪器,仅采用 6种大豆异黄酮标准品,分析测定易于进行。不采用12种大豆异黄酮标准品、仅用 6种异黄酮标准品是有科学道理的。因为 3种丙二酰基类异黄酮和 3种乙酰基类异黄酮一般条件下是测不准的。大豆种子中 3种丙二酰基异黄酮葡萄糖苷具有热不稳定性,5℃时贮存 5 d即自动水解为葡萄糖苷型异黄酮。丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮干热处理后分解得到乙酰基葡萄糖苷型异黄酮。例如,经过热处理的大豆分离蛋白、组织蛋白和炒大豆等制品中的乙酰基葡萄糖苷型异黄酮含量很高,占总异黄酮含量的 30%～50%[13]。丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮和乙酰基葡萄糖苷型异黄酮,在加热和碱性条件下,可以去掉丙二酰基和乙酰基而转化成葡萄糖苷型异黄酮。Coward等[14]发现,在较高的温度下,丙二酰基染料木苷和乙酰基染料木苷可产生脱酯化作用生成丙二酸甲酯、乙酸甲酯和染料木苷;Pandjaitan等[15]在此基础上进一步研究指出,其最佳转化温度为 50℃;此外,大豆异黄酮提取液在贮存过程中也会发生染料木苷衍生物向染料木苷的转化[14],而葡萄糖苷型异黄酮比较稳定,要在强酸高温或酶存在下,才可水解去掉葡萄糖基而转化为苷元型异黄酮[16]。检测异黄酮时要对大豆样品进行处理,处理过程中丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮含量要减少,因为脱羧生成了乙酰基葡萄糖苷型异黄酮,所以乙酰基葡萄糖苷型异黄酮含量会增加。虽然这 2类异黄酮的含量无法准确测出,但是他们在碱性条件下会生成稳定的葡萄糖苷型异黄酮。

有机化学中把酯键在碱性条件下水解称为皂化。大豆异黄酮共有 12种,经皂化之后简化成了 6种比较稳定的异黄酮。所以 AOAC提供的方法中应用了皂化技术。大豆异黄酮皂化的化学反应方程式如下:

AOAC法只用了 6种大豆异黄酮的标准品:染料木苷 (genistin)、染料木黄酮 (genistein)、黄豆苷(daidzin)、黄豆苷元 (daidzein)、黄豆黄素苷 (gly2 citin)和黄豆黄素 (glycitein)。皂化很容易完成,取适量待测样品加 3 mL、2 mol/L的 NaOH溶液,用铝箔封住塞和瓶颈,在室温下震荡锥形瓶 10 min即可。具体测定方法可参阅原文 [J.AOAC Int.84,1865(2001)]。建议大豆育种专家采用或参考 AOAC公布的大豆异黄酮检测方法。应用该方法可以方便地测定大豆异黄酮总的含量和染料木苷类、黄豆苷类和黄豆黄素苷类异黄酮含量。如果分别以染料木苷类和黄豆苷类异黄酮为大豆异黄酮育种的评价指标,只需要染料木苷、染料木黄酮、黄豆苷和黄豆苷元 4种标准品即可。

综上所述,染料木黄酮和黄豆苷元是大豆异黄酮的活性因子,建议大豆异黄酮育种专家分别以染料木苷类异黄酮含量和黄豆苷类异黄酮含量作为育种的评价指标;因为 AOAC公布的检测方法不需要高档次仪器,且仅需少量的大豆异黄酮标准品,所以建议采用AOAC公布的大豆异黄酮的检测方法。

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Evaluation Indexes and DetectionMethods in Breeding of Soybean Isoflavones

Zhang Yongzhong1,2Xu Jing1
(College of Science,NortheastAgriculturalUniversity1,Harbin 150030)
(Key Laboratory of Soybean Biology,Ministry of Education2,Harbin 150030)

The evaluation index of the breeding of soybean isoflavones now adopted is the total isoflavone con2 tent in species,and the detection method used is high perfor mance liquid chromatography orUV spectrophotometry.Chemical structure deter mines biological activity.A variety of soy isoflavone monomers have different biological activ2 ities,and they have different strength of biological activity.W ith the development of scientific research,the evalua2 tion index and detection method also need i mprovement to be more suitable formodern scientific progress.The evalu2 ation index and detection method of the breeding of soybean isoflavones are briefly introduced in this article.Genistin and daidzin contents in soybean isoflavones are recommended as breeding evaluation indexes for the breeding,and AOAC methods should be adopted in the soybean isoflavone deter mination.

soybean isoflavones,breeding,evaluation index,AOAC detection method

TS201.1

A

1003-0174(2011)01-0044-05

863计划(2008AA10Z331)

2010-02-01

张永忠,男,1953年出生,教授,硕士生导师,天然产物化学