食用油中植物甾醇测定方法的优化及含量分析

杨 虹 姜元荣 魏婷婷 王 伟

(丰益 (上海)生物技术研发中心有限公司,上海 200137)

食用油中植物甾醇测定方法的优化及含量分析

杨 虹 姜元荣 魏婷婷 王 伟

(丰益 (上海)生物技术研发中心有限公司,上海 200137)

研究了食用油中植物甾醇的检测方法,并将液相色谱法与薄层色谱法、实验室优化的方法进行了比较,结果表明,优化后的方法具有分析速度快、准确性高和精密度好的优点。同时,利用此检测方法,对油脂加工过程中植物甾醇的含量进行了追踪分析,考察了油脂在精炼过程中的甾醇损失情况。另外,还对不同种类植物油的毛油和脱臭馏出物中植物甾醇的组成及含量进行了分析,为将来相关领域开发应用方面的研究提供了参考数据。

植物甾醇 毛细管气相色谱法 液相色谱法 薄层液相色谱法 毛油 脱臭馏出物

甾醇 (Sterol)又名固醇,是一类极其复杂的化合物。甾醇在动物和植物体内均存在,动物体内以胆固醇为主,习惯上将其称为动物甾醇;而植物油脂中主要是植物甾醇在植物细胞中起着稳定细胞膜的作用。现已确认了 40多种植物甾醇,其中以β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇为主[1-2],其结构式如图 1所示。这些甾醇的结构与胆固醇结构基本相似,都属于 4-无甲基甾醇,具有相同的手性结构,结构上唯一不同之处是环戊烷全氢菲骨架带有侧链,正是这些侧链上的微小差异导致了它们的生理功能的极大不同。临床试验表明,植物甾醇具有降低胆固醇的显著作用,可以用于防治心血管疾病。最近,美国食品与药物管理局(FDA)正式批准植物甾醇可用于各类含脂肪食品中[3-4]。

目前对于甾醇定量测定方法主要有液相色谱 -紫外检测法测定法 (HPLC-UV)、薄层色谱法 (TLC)和气相色谱法 (GC)。其中液相色谱 -紫外检测法缺点在于不能将甾醇完全分离,且灵敏度低,而薄层色谱法操作繁琐费时费溶剂,不便于进行实时监控生产。本研究利用在实验室建立的气相色谱法分析了 3种主要甾醇组分的含量,并与液相色谱法和薄层色谱法相比,具有分辨率高,定量准确,操作简单等优点,并使其在工厂生产中对甾醇来源的分析,质量指标的检验更为快速有效。

图 1 主要甾醇的结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β-谷甾醇 (β -sitosterol,纯度 75%)、豆甾醇(Stigmasterol,纯度 95%)、菜油甾醇 (Brassicasterol,纯度 65%)、β-胆甾烷醇 (Cholesterol,纯度 96%):比利时 Acros公司;正己烷为色谱级。

2.0 mol/mL氢氧化钾 -乙醇溶液的配制:将 5.6 g氢氧化钾溶解在 5 mL水中.冷至室温后,用乙醇稀释至45 mL。

BSTFA+T MCS双 (三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 ∶三甲基氯硅烷 =99∶1

Agilent6890 GC-FI D、Agilent1100 HPLC-UV:美国安捷伦公司.

1.2 分析方法

1.2.1 液相色谱法

1.2.1.1 样品分析步骤

称量样品油 (1.0±0.2)g,加入 5 mL KOH-95%乙醇溶液皂化 30 min,皂化液冷却至室温后,加饱和氯化钠水溶液 25 mL移至分液漏斗中,分 3次每次用石油醚 30 mL提取,把石油醚提取液合并。用蒸馏水 25 mL多次洗石油醚层至中性,石油醚层用无水硫酸钠脱水后滤过,在旋转蒸发器中通氮气浓缩至近干,得到的残渣用无水乙醇定容,混匀,过

0.45 μm微孔滤膜后,进行 HPLC测定。

1.2.1.2 液相色谱条件

色谱柱:Agilent C18 Column(250 mm×4.6 mm×5μm);流动相:甲醇 ∶水 (98.5∶1.5,体积比 );检测波长 210 nm;柱温 50℃;流速 1.0 mL/min,进样量20μL。

1.2.2 薄层色谱法

1.2.2.1 样品分析步骤

称取约 (2.0±0.2)g试样,加入 0.01 gβ-胆甾烷醇标准品作内标,按 ISO 3596-1或 ISO 3596-2回流方式制备非皂化物,浓缩后,用薄层色谱分离甾醇。

用气相色谱测定甾醇含量。

1.2.2.2 气相色谱条件

色谱柱:SE-54 50.0 m ×250μm(id)×0.1 mm(膜厚 )毛细管柱;载气 :H2;流速:36 cm/s;柱温 :从240℃起以 4℃/min的升温速率升至 255℃;进样口温度:300℃;检测器温度:320℃;分流比:20∶1;进样量:1μL。

1.2.3 试验室新方法的前处理方法

1.2.3.1 样品分析步骤

(1)称取 200 mg油样及内标 2 mgβ-胆甾烷醇(植物油中不含胆甾烷醇,但它与植物油甾醇结构相似,保留时间接近,且能完全分离,适合做分析植物甾醇含量的内标物质)标准品于离心管中,将离心管在室温下水浴超声处理。

(2)加入氢氧化钾乙醇溶液后加盖密封,在室温下超声水浴中处理 5 min,接着放入 60℃烘箱处理60 min。取出后,放在振动混合器中震摇 2 min。

(3)冷却后加入正己烷和水。振动混合器萃取,然后在离心机中以 4 300 r/min离心 3 min。将上层有机液层用玻璃滴管转移到另一只离心管中。继续向离心管中加入正己烷。在振动混合器萃取,然后在离心机中离心。将上层有机液层用玻璃滴管转移到相应的离心管。

(4)将浓缩溶液转移到样品瓶中,在 85℃烘箱中蒸发溶液。

(5)加入 100μL BSTFA+T MCS,用加热块加热105℃促进反应 15 min。

(6)转移到自动进样器安瓿瓶,并进样 1μL。

1.2.3.2 气相色谱条件

色谱柱:HP-5 30.0 m ×320μm(id)×0.25 mm(膜厚)毛细管柱;载气:He;流速:1.0 mL/min;柱温:从 200℃起以 2℃/min的升温速率升至 300℃;进样口温度:300℃;检测器温度:360℃;分流比:50∶1;进样量:1μL。

1.2.4 数据处理

1.2.4.1 甾醇峰的定性

根据标准品如β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-胆甾烷醇等的保留时间进行定性。(如图 2和4);

1.2.4.2 甾醇峰的定量

(1)液相色谱法定量 -外标法

采用峰面积外标法,根据被测组分和标准组分峰面积比可以算出被测组分的质量分数,进行定量分析。

(2)气相色谱法定量 -内标法

①样品中单个甾醇的含量

单个甾醇的质量分数Ws=(pm×Vis×As×pis)/(Ais×ms×1 000)

式中:pm为内标质量浓度/g/L;Vis为内标体积 /μL;As为单干甾醇的峰面积;Ais为内标峰面积;ms为样品质量 /mg;pis为内标的纯度。

②样品总甾醇的含量

总甾醇的质量分数 Ws=(pm×Vis×∑As×Pis)/(Ais×ms×1 000)

式中:∑As为各个甾醇的峰面积之和。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱检测方法

对利用 HPLC检测植物甾醇含量已有相关报道[5-7],由于此方法对于检测甾醇不用衍生化即可直接进样分析,操作简便,可采用其制备色谱分离收集到甾醇各组分的标准品,所以首先考察了此方法定量的可行性。

图 2 米糠油的 HPLC色谱图

如图 2所示,此方法存在分离效果不佳、灵敏度不高的缺点,将会直接影响到最终的定量结果,所以,此方法不适合对食用油中植物甾醇进行定量分析。

2.2 薄层色谱法

2.2.1 GC前处理方法的选择

食用油中所含植物甾醇属于微量,分析时,采用先将油脂皂化处理后,再分析不皂化部分的处理手段是比较好的,因为这样易于测定油中的微量组分。而 GC法对那些微量组分有较高的灵敏度。在通常的气相色谱条件下,将未衍生的标准品直接进 GC可以得到各甾醇的峰,但各主要甾醇分离效果不理想,且拖尾较严重 (如图 3所示),影响到定量结果。而将标准品经BSTFA+T MCS试剂处理后,各甾醇的活性氢原子被硅烷基所取代,使甾醇的热稳定性更高,更易挥发,同时其极性下降,检测灵敏度提高 (如图 4所示)。

由于此方法利用薄板分离,耗时耗力,不适宜在工厂进行实时监控,于是实验室优化了样品的前处理方法,以提高分析方法的精密性和实验的可操作性。

2.3 实验室优化方法的方法学考证

2.3.1 重复性

从表 1可知,TLC色谱方法的重复性的 RSD比优化的气相色谱法差。

表 1 TLC色谱法A与优化方法B的重复性试验比较表

2.3.2 与 TLC色谱法比较结果

从表 2可知,优化的气相色谱法检测结果与 TLC色谱法结果接近。

表 2 TLC色谱法A与优化方法B的结果比较表

2.3.3 回收率的测定。

平行测定添加了 0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%植物甾醇酯的精炼玉米油的样品。薄层色谱法回收率在 80%以上,但是 RSD值均达不到定量要求,大于 10%,而经过优化前处理方法,回收率在90%以上,其 RSD值低于 6%,说明优化后的方法精密度高,重复性好,结果可靠。

图 5 TLC色谱法A与优化方法B回收率比较

3 应用

3.1 对同一批次,不同工艺下的食用菜籽油和大豆油中植物甾醇的组成及含量分析

由图 6可知,4种加工工艺下,甾醇损失都是存在的。具体损失量与工厂的生产工艺密切相关。

图 6 菜籽油和大豆油在 4种不同工艺下植物甾醇含量损失分析

3.2 对不同品种,食用植物油的毛油和脱臭馏出物中植物甾醇的组成及含量分析

近年来,随着生命科学、油脂科学与工程技术的迅猛发展,植物甾醇在医药、食品、化工、饲料和植物基因工程等领域被高度重视与关注。植物甾醇主要存在于油脂中,目前研究发现,精炼油后的脱臭馏出物中富含植物甾醇,所以在大多数研究中,一般都以脱臭馏出物作为提取原料,脱臭馏出物中一般含有10%～30%不皂化物,其中约 40%是植物甾醇,15%是生育酚[8-9]。其研究结果可以为从脱臭馏出物中直接提取植物甾醇等相关研究提供参考。

表3

图 7 各种常见植物毛油中植物甾醇平均含量图

由表 3及图 7可知,食用植物油均含有菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇,其中在含量上,以β-谷甾醇为主,其次是菜油甾醇和豆甾醇。同一类别而产地不同的植物毛油和脱臭馏出物中植物甾醇的比例基本一致,毛油总含量差异不大,而 FAD存在较大差异,可能与精炼方法、储存条件、原料的品种以及生长季节等多种因素有关。大豆油和葵花籽油的植物甾醇含量低于菜籽油和玉米油,所以由此推测我国南方居民从植物油中摄入的植物甾醇的量高于北方居民。因此建议居民可以通过食用植物甾醇含量高的植物油如玉米胚芽油、菜籽油等来增加植物甾醇的摄入量,以达到降低慢性病发生率的作用。

4 结论

4.1 研究表明,利用液相色谱法测定植物油中的甾醇含量,虽然不用衍生化即可直接进样分析,操作简便,但是分离效果欠佳,不适合选择作为定量分析手段。将 TLC与优化后的检测方法进行比较,虽然结果相近,但是 TLC操作繁琐,不适宜在工厂进行实时监控,并且重复性差,RSD远远大于 5%,加样回收率也不理想,低于 90%。而将植物油经皂化处理,有机溶剂萃取,并硅烷化试剂衍生后,再利用气相色谱测定甾醇含量,检测结果能达到良好的准确度和精密度,重复性 RSD和加样回收率均能满足定量要求。

4.2 运用优化后的检测方法,探讨了菜籽油和大豆油在 4种不同工艺下的植物甾醇的损失情况。实验表明植物油从原油 -中和油 -脱色油 -精炼油,甾醇保留量依次降低。因此应降低精炼程度,减少甾醇损失量,且不断加强对精炼过程中甾醇工艺的研究。

4.3 对不同种类的植物毛油和脱臭馏出物中甾醇含量进行了研究,结果表明,同一类别而产地不同的植物毛油中植物甾醇的总含量基本一致,脱臭馏出物种甾醇总含量存在一定的差异,可能与精炼方法、储存条件、原料的品种以及生长季节等多种因素有关。

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Opti mizingAnalysisMethod forDeter mination of Phytosterols in Edible Oils

Yang Hong Jiang Yuanrong Wei Tingting WangWei
(W i lmarBiotechnology Research&Development Center(Shanghai)Co.,Ltd,Shanghai 200137)

A method for deter mination of phytosterols in edible oilswas optimized and evaluated.After compa2 ring the method with high perfor mance liquid chromatography and thin layer chromatography,the method we devel2 oped was found to be more sensitive,rapid and accurate with good reproducibility.Using thismethod the phytosterol contents in different refining processeswere traced,and the loss of phytosterols in refining was accurately measured.Further more,the content and constitution of phytosterols in many kinds of crude vegetable oils and in deodorization distillateswere deter mined with thismethod.

phytosterol,gas chromatography,high performance liquid chromatography,crude oil,deodorization distillate

O657.7+1

A

1003-0174(2011)02-0120-05

2010-01-21

杨虹,女,1982年出生,硕士,分析化学

姜元荣,女,1970年出生,讲师,博士,油脂与植物蛋白工程