反式白藜芦醇对Aβ25-35损伤大鼠海马旁回caspase-8、caspase-9的影响

陈 群，徐 平，王顺旺，李 彬，张 丽，宋凯英

(1.遵义医学院 附属医院 神经内科，贵州 遵义 563003;2.厦门市第三医院 神经内科，福建 厦门 361100)

阿尔茨海默病是临床较为常见的神经系统退行性病变，常见于老年前期和老年期的渐进性大脑退行性疾病，也是老年性痴呆的一种主要类型。目前，对痴呆的防治尚无理想药物，已有药物主要为乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，如他克林、多奈哌齐等。但疗效有限且毒性较大而使临床应用受限。中医药防治该病方法多样、疗效满意，已引起广泛关注［1-2］。白藜芦醇(Res)是一种植物抗毒素，主要存在于葡萄、虎杖、花生、藜芦等植物中，近十几年来人们对Res多方面的研究结果证实其具有许多重要的生理活性，如:抗氧化、抗癌、保护心血管系统、雌激素样作用、延缓衰老、影响骨代谢等［3-4］。本文观察了反式白藜芦醇(Trans-resveratrol，TR)对β-淀粉样肽(Aβ25-35)损伤大鼠的海马周围皮层神经元的作用。

1 材料

TR(纯度:98%)、DHT苦味酸、RNAiso Regent液、荧光液Green Supermix、caspase-8、caspase-9 优化引物，广州华拓生物有限公司;Aβ25-35(Amyloidβ-Protein Fragment 25-35，批号 A4559)，Sigma公司。

SPF级SD雄性大白鼠，体重为300～350 g，第三军医大学野战外科研究所动物室提供，许可证号scxk(渝)2007-0005。

iCycler荧光定量PCR仪，美国 BioRad公司;Mastercycler Gradient PCR仪，德国Eppendorf;TU1810紫外可见分光光度计，北京普析仪器有限责任公司。

2 方法

2.1 造模及分组

Aβ25-35用生理盐水溶解制成1μg/μL溶液孵育12 h后使用。SPF级SD雄性大白鼠72只，Morris水迷宫训练3 d，成绩稳定后，剔除逃避潜伏期＜5 s和＞50 s的大鼠，合格的70只随机分为5组:假手术组;模型组;TR高、低剂量组和多奈哌齐对照组。除假手术组外，其他各组造模。大鼠称重，用5%水合氯醛0.7mL/100 g腹腔注射麻醉后固定于双臂脑立体定位仪上，局部头顶去毛、消毒，正中矢状位切口，将骨膜分离、剥除，确定前、后囟，并使之处于同一水平面上，取前囟为0点，切开后选择双侧海马旁回为注射靶区(前囟后3.0 mm，中线左右旁开2.2 mm，硬脑膜下2.8 mm)，定位后用颅钻孔，分别将 Aβ25-35溶液5μL缓慢注入双侧海马旁回［5］，每侧注射结束后留针5 min，用牙托粉和502胶混合物封闭钻孔［5］，缝合切口。假手术组给予等体积生理盐水。

2.2 给药

TR用生理盐水溶解制成不同浓度的溶液，制模结束大鼠清醒后开始给药。TR高、低剂量组分别给予TR 40，10mg/(kg·d)，假手术组和模型组给予等体积生理盐水，对照组给予多奈哌齐1.75mg/(kg·d)，灌胃给药，共10d。

2.3 取材

在造模后第11天每组取大鼠7只经10%水合氯醛(0.8mL/100 g)麻醉，断头取脑，置于冰水混合的人工脑脊液里［5］，用病理切片刀切取双侧海马及周围脑组织放入10%福尔马林中固定24 h以上用于TUNEL检测，判断造模是否成功，以便及时补充模型鼠。大鼠的学习记忆功能检测结束后(约制模后第17天)，大鼠经10%水合氯醛(0.8mL/100 g)麻醉，取脑，置于冰水混合的人工脑脊液里［6］，用病理切片刀切取一侧海马及周围脑组织放入10%福尔马林中固定24 h以上用于TUNEL检测，切取另一侧海马及周围脑组织放入加有RNA萃取液0.5mL的EP管中，－80℃速冻用于real time RTPCR检测。

2.4 检测法

2.4.1 TUNEL法检测大鼠海马及周边脑组织细胞凋亡情况 10%福尔马林处理后用防脱载玻片制作石蜡切片病理标本，脱蜡水化，PBS冲洗2次(3 min/次，下同)。在0.1%TrionX-100枸橼酸钠渗透液上(2～8℃)孵育8 min，PBS冲洗2次。擦干组织周围水份，每片加TUNEL反应液50μL(阴性对照2张片子不加TUNEL反应液，只加Label solution 50μL)于湿化盒中37℃、避光孵育60 min，PBS冲洗3次。擦干组织周围水份，避光条件下，在片子上滴1滴PBS放在荧光显微镜(400×)上看，每组看6个片，每张片看8个视野。按照Roche公司试剂盒说明书操作，然后在高倍镜下(400×)下计算凋亡指数(apoptotic index，AI)，即每张片选取10个细胞数最多的不重叠高倍视野计算出每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比，计算8个视野的平均凋亡细胞百分数及平均凋亡细胞百分数(每组7个样本切片)。

2.4.2 real time RT-PCR法检测大鼠海马及皮质caspase-8、caspase-9的表达 按文献［7］方法及试剂盒说明书提取、纯化RNA，测定RNA含量，进行逆转录及扩增。与试剂盒说明书不同的是所加入的引物。目的基因表达的相对定量法:以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数(cycle threshold，Ct值)为统计参数，依次计算下列数据，Ct值的平均值=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管);dCt=Ct值的平均值－中间值(相同检测基因的不同样品Ct值的平均值中居中的值，即中位数);基因的表达=2－dCt。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 TR对大鼠海马旁回神经细胞凋亡的影响

TR对大鼠海马旁回神经细胞凋亡的影响按照5组的不同情况，自试验中截图，见图1。

TUNEL染色检测再灌注后观察海马CA1区的神经元凋亡水平。用原位凋亡专用试剂盒处理后，利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区TUNEL阳性细胞数。模型组大鼠海马区可见散在的弱阳性细胞，胞体较大，着色浅。7d后低剂量组的脑缺血模型组海马区的阳性细胞数明显增多，着色较深，多为胞浆着色。而高剂量组阳性细胞明显增多，但是却变成淡色着色，说明高剂量组的效果不如低剂量组的效果凋亡水平;假手术组和对照组的细胞数胞体较大，着色浅，说明凋亡效果不如高、低剂量组和模型组。

图1 模型组(A)、低剂量组(B)、高剂量组(C)、假手术组(D)和对照组(E)细胞的凋亡显示(圆圈、黑色标注箭头分别示五组模型组海马的凋亡小体)Fig.1 Hippocampal apoptotic body of model group(A)，low dosage group(B)，high-dosage group(C)，sham group(D)and control groups(E)(An arrow shows hippocampal apoptotic body)

假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和对照组的凋亡率分别为4.64%，27.2%，16.7%，14.2%和9.12%。模型组凋亡率最高，其次是低剂量组，它们与假手术组比较均有极显著差异(P＜0.01);高剂量组和对照组的凋亡率与假手术组比较也有显著差异(P＜0.05)。

3.2 real time RT-PCR法检测大鼠海马及皮质caspase-8、caspase-9 的表达

结果见表1。假手术组大鼠海马区组织切片中可见少量caspase-9阳性细胞表达，脑缺血模型组在造模7d后海马区caspase-9阳性细胞数明显增多。模型组中caspase-8和caspase-9的表达最高，对照组次之，与假手术组比较均有极显著差异(P＜0.01);高剂量和低剂量与假手术组相比，也有显著差异(P＜0.05)。另外，低剂量组与高剂量组比较，也有显著差异(P＜0.05)。

表1 caspase-8、caspase-9 mRNA在各组的表达(n=7，±s)Tab.1 The expression of caspase-8、caspase-9 mRNA in each group(n=7，±s)

表1 caspase-8、caspase-9 mRNA在各组的表达(n=7，±s)Tab.1 The expression of caspase-8、caspase-9 mRNA in each group(n=7，±s)

与假手术组比较:1 P＜0.01，2 P＜0.05;与高剂量组比较:3 P＜0.05Compared with sham group:1 P＜ 0.01，2P＜0.05;Compared with high-dosage group:3 P＜0.05

?

4 讨论

阿尔茨海默病发病机制复杂，主要有遗传因素、炎症免疫学说、自由基学说、胆碱能学说、铝中毒学说等。有一个共识正在逐渐形成:即β淀粉样蛋白(Aβ)肽的生成和蓄积是阿尔茨海默病发病机制的中心环节。β-淀粉样是神经毒性物质，有研究表明边缘系统注射入Aβ25-35后会先表现为caspase激活，在细胞凋亡途径中，caspase-8是关键的启动型caspase，caspase-8的活化是caspase级联反应的第一步，caspase-3是该途径的最后执行者，然后才有神经元的损伤［8］。本实验用TUNEL法检测大鼠海马及周边脑组织细胞凋亡情况，模型组与其他各组有差异(P＜0.01)，进一步说明造模成功。PCR检测的caspase-8和caspase-9的mRNA的表达结果进一步表明，TR对Aβ25-35引起的脑细胞的炎症及凋亡反应有抑制作用，说明TR对Aβ25-35损伤模型老鼠可能有部分保护作用，其机制可能是抑制Aβ25-35引起的炎症反应，下调caspases-8、caspases-9mRNA的表达，从而减轻神经元的损伤。对于TR作用的量效关系还有待进一步研究。

在本实验研究过程中发现损伤海马旁回后，部分大鼠出现精神分裂症的类似症状。相关资料表明，海马旁回失活后可出现精神分裂症幻听等［9］。功能分区研究也表明，海马旁回在高度复杂的记忆场景中起关键作用［10］，边缘系统(包括海马，海马旁回)异常与大鼠学习记忆障碍有关，可能有助于精神分裂症和暴力行为的神经心理障碍研究，该研究可能成为进一步查明暴力行为的神经生物化学基础［11］。TR是否可以成为治疗精神分裂症的新药物，还有待进一步研究。但是它的可能性也为我们今后在探索治疗精神分裂症方面提供了新的思路。

［1］白慧梅.中医药治疗老年性痴呆临床研究概况［J］.河北中医，2008，30(6):658-660.

［2］李 潇，孙永福，王凤山.低分子多糖在阿尔茨海默病防治中的研究进展［J］.中国生化药物杂志，2009，30(5):344-347

［3］王红梅，石彦国，李 想，等.白藜芦醇的功能性和前景展望［J］.中国新技术新产品，2008，12:213.

［4］许书见，黄星星，朱瑞芳，等.白藜芦醇对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用［J］.中国生化药物杂志，2009，30(6):375-378.

［5］孙世晓，张皓婷，潘培坤，等.愈呆方对诱导痴呆模型大鼠学习记忆能力影响的研究［J］.中医药信息，2009，26(6):53-54.

［6］Hebert L E，Beckett L A，Scherr P A，etal.Annual incidence of Alzheimer disease in the United States projected to the years 2000 through 2050［J］.Alzheimer Dis Assoc Disord，2001，15:169-173.

［7］Gong Q H，Wang Q，Shi J S，etal.Inhibition of caspases and the intracellular free Ca2+concentration are involved in resveratrol protection against apoptosis in rat primary neuron cultures［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28:1724-1730.

［8］Arif M，Chikuma T，Ahmed M M，etal.Effects of memantine on soluble Alphabeta(25-35)-induced changes in peptidergic and glial cells in Alzheimer's disease model rat brain regions［J］.Neuroscience，2009，164(3):1199-1209.

［9］Diederen K M，Neggers S F，Daalman K，etal.Deactivation of the parahippocampal gyrus preceding auditory hallucinations in schizophrenia［J］.Am J Psychiatry，2010，167(4):427-435.

［10］Chai X J，Ofen N，Jacobs L F，etal.Scene complexity:influence on perception，memory，and development in the medial temporal lobe［J］.Front Hum Neurosci，2010，5:21-25.

［11］Yang Y，Raine A，Han C B，etal.Reduced hippocampal and parahippocampal volumes in murderers with schizophrenia［J］.Psychiatry Res，2010，182(1):9-13.