高效液相色谱法测定佛手配方颗粒中橙皮苷的含量

吴怀恩，辛 华，卢澄生，刘圆圆，甄汉深，黄 莉

(1.广西中医学院，广西 南宁 530001;2.成都中医药大学，四川 成都 611137)

佛手为芸香科植物佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)的干燥果实，又称佛手柑。性温，味辛、苦、酸，归肝、脾、肺经。具有疏肝理气、和胃止痛的功效，用于肝胃气滞，胸肋胀痛，胃脘痞满，食少呕吐等症[1]。佛手配方颗粒是佛手饮片经水提、浓缩、干燥、制粒等工序制成的单味中药配方颗粒剂。据报道[2-4]，橙皮苷是佛手饮片的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎、维持血管正常渗透压、增强毛细血管韧性、降血脂和抗肿瘤等多种活性。2005年版《中国药典》仅规定佛手药材的显微鉴别和薄层色谱鉴别，并未见含量测定。本文以高效液相色谱法(HPLC)测定制剂中橙皮苷的含量，为制定其质量标准提供依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);LG16-W型高速离心机(北京医用离心机厂);B3500S-MT超声清洗仪(上海必能信超声有限公司);BP211D电子分析天平(德国赛多利斯)。

1.2 试药

橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0721-9909);佛手配方颗粒(江阴天江药业有限公司，批号:0901041、0903054、0905115);甲醇为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Shim-pack VP-ODS柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇-0.1% 磷酸溶液(35∶65)，流速:1.0 mL/min，检测波长:284 nm，柱温:40 ℃，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于4000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品5.60 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得对照品贮备液(0℃保存)。精密吸取5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，使成每1 mL含橙皮苷56 μg的甲醇溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取佛手配方颗粒约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声提取60 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 佛手配方颗粒中所用辅料为交联淀粉。取交联淀粉适量，按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 阴性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL注入色谱仪，记录色谱图，见图1。阴性对照溶液在橙皮苷峰位置无色谱峰。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取橙皮苷对照品贮备液适量，稀释成11.2，22.4，44.8，56.0，89.6 μg/mL 的溶液，分别进样10 μL，记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，回归方程为:Y=20469.6 X －6.5，r=0.9999。结果表明，橙皮苷在11.2～89.6 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取2.2.1 项下对照品溶液 10 μL，连续进样6次，计算峰面积RSD为0.87%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取同一份供试品(批号0901041)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项下色谱条件分别在 0，2，4，6，8，12 h 进样10 μL，测定橙皮苷峰面积，RSD为1.53%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性实验

取同一批(批号0901041)供试品6份，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项下色谱条件进样10 μL，结果橙皮苷平均含量为0.2306 mg/g，RSD为2.18%。表明本法重复性良好。

2.8 加样回收率实验

取同一批(批号0901041)已知含量的供试品6份，分别精密加入一定量的橙皮苷对照品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项下色谱条件进样10 μL，测定橙皮苷的含量，并计算回收率，结果见表1。平均回收率为 98.92%，RSD(n=6)为2.03%。

图1 对照品(A)、供试品(B)和阴性对照(C)色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard sample(A)，sample(B)and blank sample(C)

表1 加样回收率测定结果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 样品含量测定

取本品3批，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样10 μL，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

表2 样品中橙皮苷含量测定结果Tab.2 Results of determination of Hesperidin in Foshou Dispensing Granules

3 讨论

3.1 提取条件的优化

预试验中采用正交实验L9(34)进行佛手配方颗粒的甲醇超声提取工艺研究，以橙皮苷的含量为评价指标，选择甲醇浓度(50%，75%，100%)、料液比(5∶1，10∶1，15∶1)、超声时间(20，40，60 min)3 个因素。结果表明因素主次为:甲醇浓度＞超声时间＞液料比，又由方差分析得到最佳提取工艺为100%甲醇，料液比5∶1，超声提取60 min。

3.2 柱温的选择

实验中发现柱温对橙皮苷的tR值影响较大，40℃时可保证与样品中其它组分有较好分离效果。

3.3 流动相的选择

笔者曾比较甲醇-水(25∶75)[1]、甲醇-1.5% 磷酸(50 ∶50)[2]、甲醇-醋酸-水(35 ∶4 ∶61)[5]、乙腈-1.5%磷酸(15∶85)[6]、甲醇-1.5% 磷酸(35∶65)等流动相，结果以甲醇-1.5%磷酸(35∶65)分离效果最好。实验结果表明随磷酸浓度的增加，峰形进一步变尖锐，但是考虑到酸度对色谱柱的影响，pH值不宜过低，故最终选用甲醇-0.1%磷酸(35∶65)为流动相。

[1]中国药典[S].一部.2005:124.

[2]宋剑锋，富同义.RP-HPLC法测定佛手饮片中橙皮苷含量[J].中华中医药学刊，2007，25(5):1036-1037.

[3]王宁芳.橙皮苷的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2009，37(8):3759.

[4]史德芳，高 虹，程 薇，等.橙皮苷生理活性功能及其提取工艺研究进展[J].安徽农业科学，2008，36(10):3936-3938.

[5]王 洁.高效液相色谱法测定健儿消食口服液中橙皮苷的含量[J].中国生化药物杂志，2007，28(1):56-57.

[6]肖培根.新编中药志[M].第二卷.北京:化学工业出版社，2003:352.