SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法

胡晓倩，陈来同，赵 健

(北京大学 生命科学学院，北京 100871)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法

胡晓倩，陈来同，赵 健

(北京大学 生命科学学院，北京 100871)

目的 建立一种操作简便、快速、灵敏度高、无毒的蛋白质电泳染色方法。方法 利用考马斯亮蓝G-250(CBB G-250)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后对蛋白质条带进行染色，对不同染色条件进行探讨，并与考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)染色法进行比较。结果 CBB G-250染色法试剂无毒，背景浅，经改良其灵敏度与CBB R-250染色法相当，达到0.1～0.5μg。结论 CBB G-250染色方法简单经济，灵敏度能够满足一般要求，适用于蛋白质电泳结果的快速分析。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;染色方法;考马斯亮蓝G-250;灵敏度

蛋白质条带染色是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的重要步骤，染色方法有多种［1］，考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)(三苯基甲烷)染色法是生化实验室中蛋白质电泳检测和定量分析常用的方法。考马斯亮蓝G-250(CBB G-250)分子结构略有不同，是一种甲基取代的三苯基甲烷，广泛应用于蛋白质溶液浓度测定［2］，因其电泳染色灵敏度稍差，应用较少。研究表明，酸性条件下CBB G-250分子的芳香环结构通过疏水相互作用形成聚集体［3］，在电泳染色中染料是以聚集体的形式与蛋白质结合，高浓度的硫酸铵可以使染料分子的聚集体增加，提高染色灵敏度并降低背景［4-5］，用中性盐作为脱色液可以快速无毒地达到很好的效果［6］。本文以 Bradford CBB G-250的染色液［2］为基础，对SDS-PAGE凝胶的染色条件进行探讨和改良，力求建立一种更简便快速、灵敏的蛋白质条带染色方法。

1 材料

大肠杆菌DH5α菌株提取液来自本院分子生物学实验室;blue plus protein marker(包含6种已知相对分子质量(Mr)的标准蛋白质，Mr16 000～94 000)，北京全式金生物技术有限公司;CBB G-250，Amresco公司;牛血清白蛋白(BSA)(进口分装)，北京中北林格科技发展有限公司。

SE250小型垂直板电泳槽及电源，瑞典GE公司;HEλIOSα紫外-可见分光光度计，英国UNICAM公司;凝胶成像仪，法国Vilber Lourmat公司;脱色摇床，美国Parmer公司。

2 方法

2.1 试剂配制

2.1.1 CBB G-250 染色液 CBB G-250 100 mg，无水乙醇50 mL，85%磷酸100 mL，用去离子水稀释至1 000 mL，滤纸过滤备用。

2.1.2 固定液 含50%甲醇或50%乙醇，10%乙酸，40%去离子水。

2.1.3 脱色液 7%乙酸溶液或0.25 mol/L氯化钾溶液。

2.2 SDS-PAGE

电泳方法参照《分子克隆实验指南》［7］，采用5%浓缩胶，12%分离胶(凝胶厚度1 mm)进行SDSPAGE电泳。电泳完毕取出凝胶，置于不同成份的固定液中固定0.5～1 h;然后将凝胶置于不同成份的染色液中，振荡染色1～3 h或过夜;弃去染色液，将凝胶置于不同成份的脱色液中脱色;对凝胶进行照相。

2.3 根据CBB G-250显色反应的机理探讨SDS对染色的影响

对CBB G-250染色液(含 15μg/mL BSA，2μg/mL SDS或含15μg/mL BSA和2μg/mL SDS)在320～800 nm波长范围内进行扫描，观察SDS对染料与蛋白质结合的影响。

3 结果与讨论

3.1 固定液的成份及固定时间对染色效果的影响

电泳过程按照常规操作，固定液中含50%甲醇或50%乙醇，其它成分相同，固定时间0.5或1 h做比较。染色结果显示，固定步骤是必需的，含50%甲醇固定0.5 h即可进行染色，但固定1 h染色效果更佳;含50%乙醇固定时间0.5 h染色效果稍差，固定1 h以上可达到同样效果;固定过程中更换固定液可以加强固定效果(图1)。可见乙醇完全可以替代甲醇作为固定液的有效成分，降低固定液的毒性。

3.2 CBB G-250染色时间对染色效果的影响

电泳和固定过程按照常规操作，用CBB G-250染色液染色1，2，3 h或过夜，结果表明染色1 h已能初步观察结果，染色3 h蛋白质条带颜色已到达饱和，与染色过夜的结果相当(图2)。所以染色2 h能够基本满足要求，对于浓度较低的样品可适当延长染色时间。

3.3 CBB G-250染色液中磷酸的含量对染色效果的影响

对染色液中含85%磷酸分别为10%，15%，20%时进行染色试验，结果显示当染色液中含10%的85%磷酸时染色效果最好。反应体系的酸度影响染料分子的质子化程度，从扫描光谱看到吸收峰的高度和位置均发生变化［3］。当染色液中含有10%的85%磷酸时，染料分子的磺酸基仍然多处于解离状态，利于与蛋白质中的碱性氨基酸残基结合。当染色液中含有15%以上的85%磷酸时，染料分子的聚集程度增加使得部分染料分子沉淀出来，造成染色效果较差。

图1 固定液的成份及固定时间对染色效果的影响Fig.1 The effect of fixative composition and fixed time on the staining

图2 CBB G-250染色时间对染色效果的影响Fig.2 The effect of fixed time of CBB G-250 on the staining

3.4 CBB R-250与CBB G-250染色灵敏度的比较

用不同浓度的BSA溶液作为样品进行电泳，利用CBB R-250和CBB G-250两种染色液分别染色，CBB R-250的染色灵敏度达到0.1μg，CBB G-250的染色灵敏度仅1μg。在CBB G-250染色液中加入10%硫酸铵，可使其染色灵敏度提高到0.1～0.5μg(图3)，基本能达到CBB R-250的染色水平。试验结果显示高浓度的硫酸铵能促进染料与蛋白质的结合，在提高染色灵敏度的同时没有加深背景。

3.5 脱色液的改良

CBB G-250染色后背景很浅，对于浓度高的样品可以直接观察到条带，利用7%乙酸漂洗2h即可脱去背景的颜色。试用0.25 mol/L氯化钾溶液进行脱色比乙酸脱色效果更明显，条带更清晰，且无毒无味，利于环保。

图3 硫酸铵对CBB G-250染色灵敏度的影响Fig.3 The effect of(NH4)2SO4 on the sensitivity of CBB G-250

3.6 SDS对CBB G-250染色的影响

对CBB G-250染色液及含有BSA和SDS的染色液在320～800 nm范围内进行扫描，从扫描图谱(图4)观察到，CBB G-250染色液在465和645 nm有吸收峰，当染料与蛋白质结合后，在595 nm处出现了一个峰与645 nm的峰叠加;当染色液中含有SDS时，染料分子及其与蛋白质结合后的扫描曲线均发生了变化，第2个峰移到660 nm，且595 nm处的吸收变得不明显。实验中也发现SDS的存在确实影响染色效果，其原因可能是由于SDS易于与蛋白质结合，它的存在干扰染料与蛋白质的结合，从而影响染色效果。实验表明在固定步骤中更换固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。

4 结论

本研究结果表明，通过采用 CBB G-250染色法，乙醇完全可以替代甲醇作为固定液的有效成分，这样可以降低固定液的毒性，使操作更加安全;染色液中含10%的85%磷酸时染色效果最好，在染色液中加入10%硫酸铵，可使其染色灵敏度明显提高，染色2 h能够达到最佳效果，对于浓度较低的样品可适当延长染色时间;用0.25 mol/L氯化钾溶液替代7%乙酸溶液漂洗脱色效果更明显，条带更清晰，且无毒无味，有利于环保;此外固定步骤很重要，更换固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。虽然CBB G-250染色法灵敏度略逊于CBB R-250染色法，但是经过实验的改良基本能达到CBB R-250的染色水平。本方法的优点在于CBB G-250能快速结合蛋白质，染色时间短，而背景颜色很浅，易于脱色，对于蛋白质含量较大的样品染色1 h不经脱色即可观察结果，并且重复性好、稳定性强，所以CBB G-250染色法是一种经济快捷实用的方法，适用于蛋白质电泳定量分析，值得推广使用。

图4 SDS对CBB G-250染色的影响Fig.4 The effect of SDSon CBB G-250 staining

［1］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.2版.北京:科学出版社，2005:63-78.

［2］Bradford M M.A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248-254.

［3］曹稳根，焦庆才，刘 茜，等.考马斯亮蓝显色剂变色反应机理的研究［J］.化学学报，2002，60(9):1656-1661.

［4］Neuhoff V，Arold N，Taube D，et al.Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250［J］.Electrophoresis，1988，9:255-262.

［5］Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver:A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis，2004，25:1327-1333.

［6］周国权，巫光宏，黄翠颜，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳的快速脱色方法［J］.植物生理学通讯，2006，42(1):95-97.

［7］J萨姆布鲁克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南［M］.2 版.北京:科学出版社，1993:880-886.

Investigation of protein staining protocols of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

HU Xiao-qian，CHEN Lai-tong，ZHAO Jian
(School of Life Sciences，Peking University，Beijing 100871，China)

Purpose To establish a simple，rapid，highly sensitive，non-toxic protein electrophoresis staining protocol.Methods By utilizing Coomassie Brilliant Blue G-250(CBB G-250)to stain the protein bands by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)，the different dyeing conditions were explored and compared to the staining of Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB R-250).Results CBB G-250 staining protocol presents non-toxic，light background and comparable sensitivity after optimization to CBB R-250 staining，which is reaching 0.1-0.5 μg.Conclusion CBB G-250 staining protocol is simple and economic.Its sensitivity could meet the general requirements，and is applicable to the rapid analysis of protein electrophoresis.

SDS-PAGE;staining method;Coomassie Brilliant Blue G-250;sensitivity

Q503

A

1005-1678(2011)02-0128-03

2010-01-26

胡晓倩，女，工程师，主要从事生物化学实验教学和研究工作，Email:huxiaoqian@pku.edu.cn。