CD24在大肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖的影响

王伟飞 王新颖 岳 辉 毛正果 陈培生

大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，大肠癌的发病率男女均处于恶性肿瘤的第3位［1］，在我国，大肠癌的发病呈逐年上升趋势。研究表明，大肠癌的发生发展是一个典型的多基因多步骤的癌变过程［2］。CD24是1种黏蛋白样高度糖基化的膜表面黏附分子，近年研究发现其在多种造血系统肿瘤及实体瘤中呈高表达［3］，而且CD24的胞质表达与乳腺癌［4］、胆管癌［5］、胃癌［6］、肾透明细胞癌［7］及前列腺癌［8］等肿瘤的预后密切相关。在大肠癌中，90.7%腺瘤和86.3%腺癌表达CD24［9］，这提示在大肠癌的早期阶段已经发生CD24的改变，说明CD24可能参与大肠癌的发生发展过程。因此，本研究检测CD24在大肠癌组织及细胞株中的表达情况，并通过构建CD24真核细胞表达质粒，初步探讨CD24对大肠癌SW480细胞生长增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本 收集我院 2007年7月～2008年12月、手术切除并经病理检查证实的大肠癌及癌旁组织标本106例，所有病例均经病理检查确诊，且排除合并有其它恶性肿瘤和手术前接受化疗或放疗的患者。全部病例中，男性65例，女性41例，年龄26～87岁，中位年龄59岁。按WHO肿瘤分类标准(大肠癌)进行组织学分型:高分化腺癌23例，中分化腺癌70例，低分化腺癌13例。按国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)联合制定的标准(2003年)进行TNM分期:Ⅰ期16例，Ⅱ期37例，Ⅲ期37例，Ⅳ期16例。

1.1.2 细胞株及试剂 大肠癌细胞株 SW1116、SW480、SW620、HCT8、LoVo及 Colo205 为本实验室储存，RPMI 1640及胰酶购自GIBCO公司，胎牛血清及青链霉素购自杭州四季青生物公司，Trizol、pcDNA3.1(+)空质粒及转染试剂lipofectamine 2000均购自invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自立陶宛MBI(Fermentas)公司，PCR反应体系购自北京赛百盛基因技术有限公司，正常肠组织cDNA文库由南方医院消化内科王继徳教授赠送，核酸纯化试剂盒购自德国Macherey-Nagel(MN)公司，内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ及连接酶购自美国NEB公司，感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司，CD24 Ab-1(Clone SN3)单克隆抗体购美国 Neomarker公司，CD24(C-20)和FITC标记的二抗购自美国Santa cruz公司，HRP标记二抗均购自武汉博士德生物公司，细胞增殖试剂盒CCK8购自上海碧云天生物技术研究所，免疫组化用SP试剂盒、DAB显色试剂盒和防脱玻片购自福州迈新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 CD24表达质粒的构建 根据 GenBank中人CD24基因(基因编号:NM 013230)设计引物，以正常肠黏膜cDNA文库为模板扩增cDNA编码区，上下游引物分别是5’-TAGGTACCACTATGGGCAGAGCAATGG-3’(F)和 5’-CCGGAATTCCGTTAAGAGTAGAGATGC-3’(R)，PCR反应体系为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36个循环，72℃延伸10 min，4℃终止反应。PCR产物及空质粒按说明书使用EcoRⅠ和kpnⅠ双酶切后纯化连接，之后进行转化，挑单克隆增菌后提取质粒，双酶切及测序鉴定。

1.2.2 细胞培养及瞬时转染 上述大肠癌细胞株使用含100 ml/L胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640完全培养液培养，置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内孵育。细胞生长至约85%融合时使用胰酶(0.05%，w/v)/EDTA(0.02%，w/v)进行传代。细胞转染操作按Lipofectmine 2000转染试剂说明书进行，在六孔板上转染4 μg质粒，对照组转染空载体pcDNA3.1(+)，实验组转染pcDNA3.1(+)-CD24。转染后48 h处理细胞，应用RT-PCR和流式细胞术进行鉴定。

1.2.3 RT-PCR分析 收集的细胞用冰预冷的PBS缓冲液冲洗3遍后，按Trizol的说明书提取总RNA，采用分光光度计进行定量，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA后进行PCR扩增，PCR反应体系为94℃预变性5 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，36个循环，72℃延伸10 min，4℃终止反应。CD24的上下游引物分别为5’-GACATGG GCAGAGCAATGGTGGC-3’(F)和 5’-GAGTGAGACCACGAAGAGACTGGC-3’(R)［10］。实验重复3 次，同时扩增 GADPH 作为内参照。

1.2.4 流式细胞术 0.05%胰酶消化细胞，按2×105个/ml的密度重悬细胞，按1∶100的工作浓度加入CD24 单克隆抗体(Ab-1，Neomarker)，冰上孵育 1h，用含有3%FBS的PBS缓冲液洗涤2次后，按1∶200的工作浓度加入FITC标记的二抗，冰上40 min，洗涤重悬后用流式细胞仪分析。同时以同型IgG作为阴性对照。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖 0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的SW480细胞、SW480-Vector细胞和SW480-CD24细胞后，用培养基制成单细胞悬液(3×105个/ml)，接种于 96 孔培养板中(100 μl/孔)，分别在转染0、24、48、72、96 h时进行检测。每组各设 6孔，在检测时更换新鲜培养基，同时加入CCK-8(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃孵育培养2 h后，应用酶联免疫标记分析仪测定，用只加培养基的空白对照孔进行调零，每孔450 nm波长的吸光度OD值(OD450)，记录结果，以时间为横轴、吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线，实验重复3次。

1.2.6 免疫组织化学染色及结果判定 上述标本离体后经10%中性福尔马林液固定24～48 h，取材，常规脱水、透明和包埋，切片，厚度为4 μm，组织蜡片置于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片烤干备用。采用免疫组化SP方法，按照免疫组织化学常规步骤操作。一抗CD24(C-20)按1∶400稀释后4℃过夜。用已知阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

CD24阳性表达者细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒。判定标准:每张切片随机选取5个不同高倍视野(400×)进行观察。染色结果综合染色强度及阳性细胞百分数两个方面进行半定量分析。指标染色强度判定:无染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞百分数判定:阳性细胞百分数＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～75%为2分，＞75%为3分。将染色强度与阳性细胞百分数分值相加即为切片各指标最终得分:0～1分为阴性(－)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(+ +)，5～6分为强阳性(+ + +)。所有切片采用双盲法，由两位病理科医师独立阅片评分。

1.3 统计学分析

结果均应用SPSS 13.0软件进行统计分析。流式细胞术实验结果取3次结果的平均值，增殖实验取3次实验结果中的1次作为统计结果，采用析因设计的方差分析;免疫组化中CD24染色强度(等级资料)与患者性别、年龄和肿瘤部位的关系分析采用非参数秩和检验，而表达强度与TNM分期和肿瘤分级的关系分析采用Spearman秩相关检验。

2 结果

2.1 CD24在大肠癌组织中的表达

CD24在大肠癌组织中的染色定位在细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒样染色，而在癌旁正常黏膜中几乎无染色。CD24膜表达阳性率为34.9%，表达水平与肿瘤分级呈负相关(γ = －0.201，P=0.038)，而与患者性别、年龄及肿瘤分期无相关性(表1)。CD24质表达阳性率为89.6%，其表达水平与肿瘤分级(γ=0.235，P=0.015)和肿瘤分期(γ =0.269，P=0.005)呈正相关性，与患者性别、年龄及肿瘤部位无相关性(表2)。

2.2 CD24在大肠癌细胞株中的表达

采用 RT-PCR法检测发现，CD24在 SW620和Colo205细胞中呈高表达，在SW1116细胞中呈中度表达，而在SW480、HCT8和LoVo细胞中几乎无表达。进一步应用流式细胞术从蛋白质水平检测CD24的表达，其结果与采用RT-PCR法检测的结果一致。

2.3 构建CD24表达质粒并瞬时转染SW480细胞

对重组质粒进行双酶切(EcoRI和KpnI)，得到265 bp的片段，与预计片段大小一致，而空载体没有相应条带(图1A);质粒测序证实重组质粒插入片段与Genebank的序列完全一致。上述结果提示CD24在SW480细胞中呈低表达，故选择转染SW480细胞使其过表达CD24，同时转染空载体作为阴性对照。如图1B所示，RT-PCR检测结果提示，CD24在重组质粒转染组中呈高表达，而在空白对照组和空载体组中呈低表达。应用流式细胞术检测结果显示，CD24重组质粒转染组在蛋白质水平也呈明显的高表达(图1C)。

表1 CD24膜表达与大肠癌临床病理参数的关系(例，%)

表2 CD24质表达与大肠癌临床病理参数的关系(例，%)

图1 构建pcDNA3.1(+)-CD24表达质粒并瞬时转染SW480细胞

2.4 CCK-8法检测大肠癌细胞的增殖情况

增殖实验分为转染重组质粒组、转染空载体组(阴性对照组)和试剂组(空白对照组)，分别于转染后24、48、72、96 h应用 CCK-8法测定细胞活性情况。结果提示，转染重组质粒组细胞在转染48、72和96 h时，活性均较阴性对照组和空白对照组明显增强(P＜0.001)(图2)，提示CD24促进大肠癌SW480细胞的增殖。

图2 CD24促进大肠癌细胞的增殖曲线图

3 讨论

CD24通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上，具有多个N-或O-连接的糖基化位点。而且，CD24分子在进化中获得了更多的丝氨酸和苏氨酸残基，使其成为更典型的黏蛋白样膜表面黏附分子［3］。P-选择素是CD24已经被识别的唯一配体［11］，它主要表达在激活的内皮细胞和血小板上［12］。在生理状态下，CD24通过和P-选择素结合促进肿瘤细胞黏附在血管内皮细胞上［13］，并促进肿瘤细胞在肺部形成转移灶［14］。因此，CD24的结构决定其与肿瘤细胞的迁移和转移密切相关。

在本研究中，我们应用免疫组化方法，检测大肠癌及癌旁正常组织中CD24的表达情况，结果表明，CD24在大肠癌组织中呈高表达，质表达和膜表达阳性率分别为89.6%和34.9%，而在癌旁正常黏膜中几乎没有表达。而且，CD24的质表达水平与肿瘤分级分期呈正相关关系。这表明CD24在大肠癌的发生发展中起重要的作用。

Baumann等［15］发现高表达CD24不仅促进乳腺癌和胰腺癌细胞与细胞外基质的黏附、迁移和侵袭，而且，体内和体外实验都显示其促进癌细胞的生长和增殖。Smith等［16］应用siRNA干扰技术降低CD24的表达后，膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞的增殖明显受到抑制。在本研究中，为了进一步验证CD24对大肠癌细胞生物学行为的影响，我们构建了CD24的表达质粒 pcDNA3.1(+)-CD24，并选择 CD24低表达的SW480细胞作为转染对象。结果表明，过表达CD24后SW480细胞在体外的生长和增殖明显加快，这说明CD24不仅与肿瘤的迁移和黏附有关，而且，与肿瘤细胞的增殖也密切相关。但是，CD24促进癌细胞增殖的机制并不清楚。Kim等［17］发现CD24对乳腺癌细胞的增殖作用可能与CyclinD1和p27有关。连续切片的免疫组化染色表明，在胆管癌组织中CD24表达与p-MAPK呈明显的负相关关系［5］。这些研究说明CD24可能通过细胞内的某些信号分子促进肿瘤细胞的增殖作用。

总之，本研究表明CD24在大肠癌的组织中呈高表达，而且可促进大肠癌细胞在体外的增殖作用，这说明CD24在大肠癌的发生发展中起重要的作用。但是，其发生作用的具体机制并不清楚，包括相互作用的分子、结构以及与细胞内信号通路的关系，因此，需要进一步深入研究。

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