p16基因在乳腺浸润性导管癌中甲基化的研究

范昭 叶静 龙霞 张信

肿瘤表观遗传学是一门新兴科学，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、基因组印迹和非编码RNA调控等几个方面。其中，DNA甲基化与肿瘤的关系是研究的热点。近年来，日益增多的研究表明肿瘤的发生、进展和转移与DNA甲基化密切相关。p16基因作为抑癌基因，其第1外显子5'启动子区域CpG岛的甲基化在多种肿瘤的发生发展中起重要作用［1］。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应法(methylation-specific PCR，MSP)，检测乳腺浸润性导管癌组织及乳腺非癌组织中p16基因的甲基化状态，以探讨p16基因甲基化在乳腺癌发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集我院甲状腺乳腺外科2007年3～10个月，手术切除的新鲜乳腺浸润性导管癌组织共42例，作为癌症组;对照组为21例乳腺良性病变旁正常乳腺组织，包括纤维腺瘤19例和乳管内乳头状瘤2例，此外，对照组还包括癌旁正常乳腺组织3例。所有病例均为女性，年龄19～70岁，平均35.6岁，术前均未接受过放化疗，并经病理组织学检查证实，－80℃速冻保存。

1.2 方法

1.2.1 组织DNA提取 按照QIAamp DNA Mini Kits 51304试剂盒(Qiagen公司)说明书进行操作，紫外分光光度仪检测其含量和纯度。

1.2.2 甲基化修饰 所有标本DNA均取1.0μg进行甲基化修饰，操作流程参照CpGenome TM DNA Modification Kit S7820(Chemicon公司)甲基化试剂盒说明书，修饰后的DNA分装储存。

1.2.3 MSP扩增 PCR反应试剂盒为2×PCR Master mix K0171(Fermentas公司):2×PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各 1 μl(10 pmol/μl)，甲基化后的DNA2 μl，用水补至 25 μl。p16 基因扩增采用巢式PCR，第一轮PCR扩增条件:95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循环 35 个周期后，最后 72℃ 延伸 8 min。巢式 PCR引物，F:5'-GAAGAAAGAGGAGGGTTGG-3'，R:5'-CTACAAAC CCTCTACCCACC-3'。取 PCR 产物 0.3 μl做第二轮PCR，p16(甲基化与非甲基化)扩增条件:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30个周期，最后72℃延伸8 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。p16甲基化引物，MF:5'-TTATTAGAGG GTGGGGCGGATCGC-3'，MR:5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'，片段大小为 150 bp;非甲基化引物，UF:5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3'，UR:5'-CAACCCCAAACCA CAACCATAA-3'，片段大小为151 bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.00软件进行统计学处理，应用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

42例散发性乳腺浸润性导管癌中，有18例检测到p16基因启动子甲基化，甲基化率为42.9%;24例乳腺非癌组织中检测到2例(均为乳腺纤维腺瘤)甲基化，甲基化率为8.3%;其中3例癌旁正常组织甲基化均为阴性，对应的癌组织有2例甲基化阳性，1例甲基化阴性。经统计学分析，p16基因启动子的甲基化率乳腺癌组与非癌组比较差异有显著性(χ2=8.619，P ＜0.05)，见图 1。

图1 p16基因在乳腺癌和非癌组织中的甲基化情况

3 讨论

乳腺癌的发生、发展及转移与细胞周期调控异常密切相关，特别是G1期相关的各种因子，包括正向调节作用的细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶;负向调节作用的细胞周期蛋白依赖性因子、抑癌基因产物，这些蛋白可以独立或协同促进或抑制恶性肿瘤的发生和发展。p16基因是人类发现的第1个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，属于细胞周期蛋白依赖性激酶基因家族，是细胞周期负调控基因。p16蛋白能与周期蛋白竞争结合细胞周期素依赖酶(CDK4、6)，从而抑制细胞周期素D与CDK复合物的活性，阻止细胞进入G1/S期，对细胞周期起反向调节作用，抑制细胞的分裂与增殖。若失去p16蛋白的抑制作用，细胞会异常增生、分裂，最终失去控制，导致肿瘤的发生。

研究证实在原发性肿瘤中p16基因突变、缺失率相对较低，而甲基化发生频率很高。基因异常甲基化是人类肿瘤早期发生的1个重要事件，p16基因甲基化存在于大多数肿瘤中，如子宫内膜癌、胰腺癌、肺癌及白血病中都有报道。Wong等［2］采用MSP方法，对48例乳腺癌石蜡标本进行检测，p16基因甲基化率为27.1%，有淋巴结及远处转移的甲基化率高于无转移的甲基化率。发生甲基化的标本p16蛋白失表达率高于非甲基化病例，认为p16基因超甲基化是乳腺癌中常见的分子生物学改变之一，其超甲基化和乳腺癌浸润及转移有相关性;甲基化是p16基因失活的主要方式之一。但该研究没有对非癌组织进行甲基化检测。在Jing等研究中同样证明了乳腺癌中p16基因超甲基化是其mRNA和蛋白失表达的主要原因［3］。随后，Dominguez等［4］和 Munot等［5］也采用 MSP 方法对大量乳腺癌患者进行p16基因的甲基化检测，甲基化率分别为19%(19/100)和 50%(100/200)。Vallian 等［6］采用MSP和重复序列PCR(PCR-REP)2种方法，对伊朗乳腺癌患者进行p16基因甲基化检测，甲基化率分别为35.7%和40%，2种方法研究结果相差不大，他们认为在伊朗乳腺癌患者中p16基因超甲基化是早期常见的事件，可将p16基因甲基化状态用在伊朗乳腺癌患者诊断和治疗上。在我们研究中，p16基因在散发性乳腺浸润性导管癌中甲基化率为42.9%，与大多数研究结果一致。我们在24例乳腺非癌组织中除了2例乳腺纤维腺瘤检测出甲基化，其余均未发生甲基化，两组间差异有统计学意义，说明p16基因甲基化对于乳腺癌的临床早期诊断具有一定指导意义。由于收集的癌组织标本均为浸润性导管癌，并且多数为Ⅰ期，故未进行甲基化与临床病理特性相关性分析。

近年来，研究发现肿瘤患者血浆中存在来源于肿瘤细胞的游离DNA，在癌症发生过程中涉及一系列基因突变及甲基化的改变，为诊断提供分子标记。血浆DNA具有取材方便和无创性等特点，通过检测这些分子标记为肿瘤的早期诊断及病情监控提供可行性。p16基因在乳腺癌患者外周血中甲基化检测的研究也有报道。同时收集61例乳腺癌患者血浆与相应组织标本，应用MSP技术，检测p16基因甲基化状态。61例乳腺癌患者血浆和相应癌组织中，p16基因的甲基化检出率分别为44.3%和46.2%，两者检出率无统计学差异［7］。Feng等［8］研究检测到 p16基因在散发性乳腺癌患者血浆标本中甲基化率为25.4%，与相应癌组织标本中甲基化率28.6%相差不大，进一步说明p16基因很可能成为乳腺癌诊断的分子标记物，具有临床应用的价值。

［1］Bian YS，Osterheld MC，Fontolliet C，et al.p16 inactivation by methylation of the GDKN2A promoter occurs early during neop1astic pmgression in Barrett’s esophagus〔J〕.Gastroente-rology，2002，l22(4):1113.

［2］Wong SC，Chan J K，Lee K C，et al.Differential expression of p16/p21/p27 and cyclin D1/D3，and their relationships to cell proliferation，apoptosis，and tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.J Pathol，2001，194(1):35.

［3］Jing F，Jun L，Yong Z，et al.Multigene methylation in serum of sporadic Chinese female breast cancer patients as a prognostic biomarker〔J〕.Oncology，2008，75(1-2):60.

［4］Dominguez G，Silva J，Garcia JM，et al.Prevalence of aberrant methylation of p14ARF over p16INK4a in some human primary tumors〔J〕.Mutat Res，2003，530(1 ～2):9.

［5］Munot K，Bell SM，Lane S，et al.Pattern of expression of genes linked to epigenetic silencing in human breast cancer〔J〕.Hum Pathol，2006，37(8):989.

［6］Vallian S，Sedaghat M，Nassiri I，et al.Methylation status of p16INK4A tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(8):991.

［7］今 毅，谢 文，余小萍，等.乳腺癌患者肿瘤循环DNA的定量分析〔J〕.第四军医大学学报，2007，28(11):1024.

［8］Feng J，Hu LH，Lu J，et al.Diagnostic value of BRCA1 and p16 gene methylation in sporadic breast cancer〔J〕.Chin J Cancer，2009，28(4):436.