p53和c-erbB-2表达与胃癌进展的关系

丁春明 喻 钢 朱宝华

胃癌的发生和发展涉及许多肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因，其中较为引人注目的是p53和c-erbB-2。大量研究表明，p53和c-erbB-2与胃癌的生物学行为密切相关，但对其在胃癌发展过程中的作用则尚未完全明了。浸润性生长是胃癌最具特征性的生物学行为之一，我们采用免疫组化方法，对早期和进展期的胃癌手术切除标本进行研究，初步探讨p53和c-erbB-2的阳性表达与胃癌进展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集姜堰市人民医院普外科2005年5月～2008年5月、手术切除的胃癌病例139例，均经病理检查证实，包括早期胃癌54例，进展期胃癌85例。其中男性78例，女性61例，年龄38～77岁。所有病例术前未接受放疗、化疗。

1.2 主要试剂

p53和c-erbB-2鼠抗人单克隆抗体均购自Santa Cruz公司，免疫组化S-P试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 方法

标本常规福尔马林液固定，石蜡包埋切片，分别行HE和免疫组化染色。采用免疫组化S-P试剂盒检测，操作按说明书进行。石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，双蒸水冲洗3次×5 min;每张切片滴加3%H2O250 μl，37℃、10 min，以消除内源性过氧化物酶活性;双蒸水冲洗 3次 ×5 min;抗原修复，将盛有0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)的容器，放入微波炉内高火加热2 min后取出(温度保持在92℃ ～98℃)，将切片置入，放回微波炉，低火维持10 min，将容器取出，自然冷却至室温(约40 min);取出切片，PBS浸泡2次×3 min;每张切片滴加50 μl 10%正常山羊血清封闭，室温下放置10 min，甩去;每张切片滴加50 μl一抗工作液(鼠抗人p53、c-erbB-2单克隆抗体)，4℃过夜;PBS冲洗3次×2 min;每张切片滴加二抗50 μl(生物素化羊抗鼠 IgG 1∶100)，37℃孵育30 min;PBS冲洗3次×2 min;每张切片滴加辣根酶标记链酶卵白素50 μl，37℃孵育15 min;PBS冲洗5次×4 min;每张切片滴加新鲜配制的DAB显色剂50 μl，镜下观察2～5 min;自来水充分冲洗;苏木精复染细胞核，双蒸水冲洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察。

1.4 结果判定

p53、c-erbB-2均以细胞核或细胞核伴有胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，只有胞质阳性视为非特异染色［1］。高倍镜下分别计数至少500个肿瘤细胞，以阳性细胞数＞10%作为c-erbB-2或p53阳性标准。

1.5 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行统计分析。计数资料应用频数或率表示，率的比较采用Pearson χ2检验，频数的比较采用秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 早期胃癌和进展期胃癌中p53阳性表达率比较(表1)

表1 早期胃癌和进展期胃癌中p53阳性表达率比较(例)

由表1可见，进展期胃癌p53阳性表达率较早期胃癌高，两者比较有统计学意义，χ2=6.667，P=0.010＜0.05。

2.2 早期胃癌和进展期胃癌中c-erbB-2阳性表达率比较(表2)

进展期胃癌c-erbB-2阳性表达率高于早期胃癌，χ2=31.715，P=0.000 ＜0.01，两者比较有统计学意义，见表2。

表2 早期胃癌和进展期胃癌中c-erbB-2阳性表达率比较(例)

2.3 c-erbB-2与p53表达的相关性分析(表3)

表3 c-erbB-2与p53表达的相关性(例)

2.4 p53和c-erbB-2阳性表达与胃癌进展的关系(表4)

表4 p53和c-erbB-2阳性表达与胃癌进展的关系(例)

由表4可见，无论p53是否阳性表达，进展期胃癌c-erbB-2阳性表达率均显著高于早期胃癌(p53表达阳性组，χ2=8.391，P=0.004 ＜ 0.01;p53 表达阴性组，χ2=21.474，P=0.000 ＜0.01)。分层危险度估计结果:p53表达阳性组OR=5.271＞1，95%可信区间为1.622～17.126;p53 表达阴性组 OR=16.762 ＞1，95%可信区间为 4.302～65.306，说明 c-erbB-2阳性表达是胃癌发展的1个危险因素。OR值一致性检验结果:χ2=1.614，P=0.204 ＞0.05，说明 p53 表达阳性和阴性的OR值比较无统计学意义。协变量分析结果:χ2=26.554，P=0.000 ＜0.01，说明在剔除 p53 的影响后，c-erbB-2阳性表达与胃癌进展仍显著相关。公共OR值估计结果:公共OR值=8.962＞1，95%可信区间为3.747 ～21.435。

3 讨论

3.1 p53基因和c-erbB-2基因

p53基因是抑癌基因，位于人类17号染色体短臂17p13.1［2］，编码分子量为 53 kD 的磷酸化蛋白，可分为野生型和突变型。野生型p53具有调节细胞增殖及凋亡双重作用。它能维持细胞的正常生长，当细胞遭受损害，野生型p53就诱导DNA受损的细胞进入G1/G0静止期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复，若修复失败则诱导损伤的细胞凋亡。正常情况下，p53蛋白的半衰期甚短，而且极不稳定，采用常规免疫组化方法很难测出。当p53基因缺失、突变导致表达异常时称为突变型p53，它失去上述细胞调节功能，并且稳定性增加，半衰期延长，在细胞中堆积，从而引起细胞的转化和癌变。如果采用免疫组化方法，检侧出p53蛋白间接表明该基因已突变失活［3］。本研究中，我们将染色细胞数＞10%作为判定p53蛋白过表达的标准［4］，即表达阳性。

c-erbB-2基因(又称HER2/neu)是癌基因，定位于人类染色体17q21，编码产物为185 kD的糖蛋白［5］，即 c-erbB-2 蛋白(ERBB2)。ERBB2 主要在胚胎发育时开始表达，成年后正常组织可检测到少量［6］。它和表皮生长因子受体(EGFR)具有高度同源性，同属于受体酪氨酸激酶(RTK)Ⅰ家族，该家族包括ERBB1(EGFR)、ERBB2、ERBB3和 ERBB4。在生理条件下，ERBB2是与其他RTKⅠ受体形成异二聚体而被激活，参与细胞关键功能的调控，涉及细胞生存、增殖、凋亡、迁移和分化。当某些因素导致ERBB2过表达时，将导致异常的ERBB2同型二聚体形成以及通过包含ERBB2的异二聚体增强信号传递，导致RTKⅠ调控网络瓦解，并具有肿瘤转化活性［7］。本研究中，我们采用免疫组化方法检测c-erbB-2蛋白，并将染色细胞数＞10%作为判定c-erbB-2蛋白过表达的标准［8］。

3.2 p53和c-erbB-2的表达及其相关性

我们采用免疫组化的方法对139例胃癌标本进行了检测，结果显示p53阳性率为48.9%，略低于既往文献报道的50% ～55%［2］;而文献报道的c-erbB-2的阳性率则很不一致，我们的结果为44.6%。在不同发展程度的胃癌中，p53和c-erbB-2阳性率并不相同，随着胃癌的进展，p53和c-erbB-2阳性率都显示出上升的趋势(P ＜0.05，P ＜0.01)，说明抑癌基因 p53的突变和癌基因c-erbB-2的激活随着胃癌的发展均显著增加。我们比较了p53阳性组和p53阴性组的c-erbB-2阳性表达率，结果显示c-erbB-2阳性表达率在p53阳性组为54.4%，在p53阴性组则为35.2%，两者比较存在显著差异。p53阳性组c-erbB-2表达阳性率明显高于p53阴性组，说明c-erbB-2和p53的表达具有某种相关性。我们推测，抑癌基因p53突变之后丧失了对异常基因表达的抑制和修复作用，使癌基因c-erbB-2的异常表达较p53未突变时相对容易。

3.3 p53和c-erbB-2表达与胃癌进展的关系

为了进一步研究p53和c-erbB-2分别与胃癌进展的关系，我们以p53为分层变量，对p53和c-erbB-2进行分析。结果显示:分层危险度估计，p53表达阳性组和p53表达阴性组OR值均＞1，说明c-erbB-2阳性表达是胃癌发展的1个危险因素;OR值一致性检验，p53表达阳性和阴性的OR值比较无统计学意义，说明p53是否阳性表达对胃癌进展无明显影响;协变量分析，在剔除p53的影响后，c-erbB-2阳性表达与胃癌进展仍显著相关。我们推测，在胃癌的发展过程中，由于突变的p53失去了抑癌功能，不能修复损伤的DNA，有利于其他突变的基因发挥作用，而这些基因才真正赋予了胃癌恶性生物学行为，例如c-erbB-2。

总而言之，胃癌的发病是1个多基因多步骤的过程，在这个过程中既有抑癌基因的突变，也有癌基因的激活。抑癌基因p53突变有利于癌基因c-erbB-2的表达;c-erbB-2阳性表达是胃癌发展的1个危险因素，与胃癌的浸润发展密切相关。

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［5］陈 斌，罗荣城，崔 斐，等.胃癌HER/neu基因表达与预后的相关性〔J〕.南方医科大学学报，2006，26(3):344.

［6］卓丽娟，高美钦.C-erbB-2在胃癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系〔J〕.山西医科大学学报，2007，38(11):1021.

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