CRMP-1真核表达载体的构建

乔宠，常瑞晶，王春辉

（1.中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004；2.中国人民解放军沈阳军区总医院肝胆外科，沈阳 110016）

坍塌反应调节蛋白1（collapsin response mediator protein-1，CRMP-1），也命名为二氢嘧啶酶/蛋白水解酶相关蛋白1（dihydropyrimidinase related protein-1，DRP-1 or dihydropyrimidinase-like1，DPYSL1），是坍塌反应调节蛋白（collapsin response mediator protein，CRMP）家族成员之一，在神经系统表达最高，尤其是胚胎发育期，参与轴突引导、核苷碱基、核苷类、核苷酸和核酸代谢。近年来研究发现该蛋白参与突起生长、细胞变形和肿瘤细胞的转移等过程［1］，本研究拟构建该基因的表达载体，为进一步研究该蛋白在肿瘤转移中的生物学作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coli Competent cell DH5a和p3x-FLAG-myc-CMV-24表达载体由中国科学技术大学微尺度实验室孙斐教授提供；200DNA ladder marker，HindⅢ，SalⅠ限制性内切酶，连接酶solutionⅠ以及一步PCR法试剂盒购自TaKaRa公司；PCR纯化试剂盒购自Omega公司；质粒小量提取试剂盒购自Axygen公司。细胞培养基DMEM、FBS、PBS购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 CRMP1-p3x-FLAG-myc-CMV-24克隆载体构建：从CRMP-1（GenBank序列号NM_001313；NP 001014809）基因的完整阅读框（open reading frame，ORF）序列的两端设计引物，上游引物为5′GGTCAAGCTTATGCGTACCAGGGCAAGA3′，下游引物为 5′ATGTCGACTCAACCGAGGCTGGTGATGTTG3′，引物中包含起始密码子和终止密码子，扩增目的基因片段长度为1 737 bp。将未经过任何处理，且正常培养基培养的10×106293T细胞按照Trizol法提取RNA，根据说明书操作，提取的RNA-80℃保存。依照RT-PCR反应试剂盒说明书，50μL体系PCR。反应条件变性50℃30 min，退火94℃2 min反转录cDNA，按94℃ 30 min，60℃ 30 s，72℃ 2 min共 30个循环进行PCR反应。PCR产物用DNA回收试剂盒回收、纯化。回收产物30μL。将带有酶切位点的目的片段CRMP-1与之所要连接的载体p3x-FLAG-myc-CMV-24进行双酶切，限制性内切酶为HindⅢ和SalⅠ。37℃培养箱5h。用连接酶solutionⅠ，按照说明书进行，16℃1 h。将连接产物转化到制备的感受态E.coli中，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，将平板放入37℃倒置培养过夜。

1.2.2 鉴定：（1）提取质粒及酶切鉴定：在平板上挑取4个单克隆点，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，250 r/min摇菌过夜，离心收集菌液，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒，显示4个克隆点均连接上目的片段，然后用HindⅢ和SalⅠ双酶切，酶切产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，显示前3个泳道切出目的条带，第4个泳道为构建错误的片段，为进一步验证所构建载体的正确性，将前3个点所摇出的菌液送去测序；（2）测序：将酶切验证正确的阳性克隆点摇菌37℃过夜，送菌液至英俊测序公司进行测序。

2 结果

从293T细胞中提取的总RNA可见3条带（图1），分别是 28 s，18 s，5 s，未见其余条带，在转化后，将挑取的单克隆点提取质粒，如图2，根据其大小位置与空载体的对比，证明基因片段已经连接上.重组表达质粒p3x-FLAG-myc-CMV-24/CRMP-1双酶切鉴定，图3可见2条带，一条为质粒的长度4.7 kb，目的片段1 737 bp，测序结果提示插入片段为目的片段，且进行基因同一性比较为99.9%，氨基酸同一性比较为100%，并且插入方向正确（图4）。

图1 提取的293TRNA电泳图Fig.1 Extraction of 293 TRNA electrophoresis diagram

3 讨论

图2 CRMP-1基因真核重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24构建Fig.2 Construction of the recombinant eukaryotic expression plazmid

图3 质粒酶切电泳图Fig.3 Plasmid electrophoresis figure after restriction enzyme cutting

图4 CRMP-1测序结果图Fig.4 CRMP-1 sequencing results

CRMP属于磷酸蛋白家族，最先在神经系统中发现，认为其主要在神经系统中表达［1］，特别是在胚胎生成时的神经系统中［2］。目前研究一致认为，CRMP参与神经突突起生长并引导其生长方向［3］。CRMP家族有5个同源性胞质蛋白，生理上参与信号转导，分别是 CRMP-1、CRMP-2、CRMP-3、CRMP-4和CRMP-5，最初的研究表明它们可参与神经元分化和轴突引导，并且在这些成员中除CRMP-1之外的所有成员均有相互作用［4］。免疫细胞化学研究显示：CRMP家族主要分布在生长锥的板状伪足和丝状伪足，轴突及神经体中，CRMP-1、CRMP-4、CRMP-5发现主要在小鼠胚胎脑组织中表达，但在成年小鼠脑组织中却很少检测到。

最近研究表明：CRMP在神经发育过程中可抑制轴突延伸，参与微管动力，延长细胞周期［5］，并可在肺癌细胞浸润调节中形成一个类似的信号网络。可以说该家族蛋白能调节发育中的神经细胞和血管系，使之几乎可以浸润任何组织。所以这些抑制行为普遍存在［6］。Zhang等［2］在鼠的脑中，发现CRMP（CRMP1、CRMP2和CRMP4）经过磷酸化方式进行调节，通过磷酸化后产生生物学作用，这3个成员与严重外伤和神经中毒相关，但是他们空间上和时间上的表达和磷酸化的分子机制仍不清楚。

CRMP-1是一个分子量为62 kDa的磷酸化蛋白。基因位于4号染色体上，全长1 719 bp，由14个外显子组成。是CRMP家族成员之一，首先在神经细胞中被发现，认为是脑中特异性蛋白，参与在神经发育过程中诱导生长锥的衰亡［1，7］。通过原位杂交和免疫组化方法，发现CRMP-1在鼠胚胎小脑组织中高表达，最近几年的研究发现该蛋白在嗅球、下丘脑和视网膜中均有表达。在细胞分裂间期，运用荧光技术发现CRMP-1主要分布在胞质，然而在某些细胞中CRMP-1既分布在胞质也分布在胞核，同CRMP家族一样，CRMP-1具体作用机制目前尚不清楚。

有关CRMP-1在神经系统的生理作用主要有：（1）调节轴突引导的信号转导和神经细胞迁移：可能通过Cdk5磷酸化CRMP-1来调节参与大脑皮层中壁板蛋白semaphorin3A引导的脊柱发育［7］。可通过调节Reln信号通路来调节神经元细胞迁移。并参与神经元增殖、分化、迁移和轴突导向［8］，在微管动力方面也起着重要的作用［9］。并可以感受到外界刺激引起神经细胞衰亡，突触萎缩及生长锥瓦解，作为信息传递的重要调节者，对细胞骨架的聚合作用有极大的影响；（2）CRMP-1证明与丛状蛋白依赖的神经功能有关。可能参与了在成年海马神经突起的生长，有研究证明缺失CRMP-1可能会影响长时程的增强和空间学习和记忆［10］。

起初人们认为CRMP-1是在脑中是特异性的蛋白，但最近的研究表明人类CRMP-1基因表达水平可以影响脑外癌症的浸润和转移。CRMP-1蛋白水平和癌症浸润、转移的程度成负相关，Goshima等人通过使用肺癌细胞系CL1–5转染并过表达CRMP-1基因，通过形态学和体外浸润试验以及体内试验，表明CRMP-1基因在癌细胞浸润和转移过程中起到一定的作用，可能是一种抑制癌细胞基因［11］，所以目前将CRMP-1基因定义为抑制浸润基因。此后也有其他文献报道，在CRMP家族中，只有CRMP-1有这种特殊的癌细胞抑制浸润作用。研究发现CRMP-1 参与大鼠泌乳素瘤的浸润［12］。Shih，Chu 等［1，13］研究，在肺腺癌患者中，低表达人CRMP-1基因的患者癌细胞浸润更深以及存在远处淋巴结转移，高表达人CRMP-1基因的患者则发病间隔时间和生存期明显延长，Goshima，Chang 等［11，14］通过改良的细胞浸润试验以及动物模型测转移活力试验，表明CRMP-1可参与抑制人类肺腺癌细胞的浸润和转移。有研究发现CRMP-1基因对肺腺癌细胞的浸润作用可能通过NF-kappaBp50负反馈来调节［15］。

目前仅CRMP-2、CRMP-5研究较多，人CRMP-1蛋白研究也仅限于基础研究，其结构域的作用不清楚，活性部位没有鉴定出。CRMP-1在迁移和浸润方面的作用，除了肺癌研究之外其他领域尚未涉及。我们构建CRMP-1表达载体，为将来进一步研究该基因在其他领域中，尤其是在产科方面及子痫前期方面的生物学作用及用于临床诊断和治疗方面奠定基础。［致谢：本课题在选题及研究过程中特别感谢中国科学技术大学生殖生物学实验室孙斐老师为我提供了良好的研究条件，姚桂东、尹贻蒙、王贵栓、刘琳、阴绵绵等在实验技术上的指导，谨向各位同仁表示诚挚的敬意和谢忱。］

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