高效液相色谱法测定硫酸小檗碱注射液的含量

李华岑，刘素梅，臧合英，周红霞，班付国

(河南省兽药监察所，郑州 450008)

硫酸小檗碱注射液［1］是目前临床上较为常用的抗菌药，主要用于治疗肠道细菌性感染。标准中硫酸小檗碱含量测定方法为滴定法，操作比较繁琐、费时。在原有研究的基础上［2］，建立了高效液相色谱法测定硫酸小檗碱注射液含量的新方法。该法操作较简单，用于测定硫酸小檗碱注射液，结果准确。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Waters 2695高效液相色谱仪(带紫外检测器);BP211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司);盐酸小檗碱对照品(中国兽医药品监察所，批号Z220600);硫酸小檗碱(东北制药总厂，20091017);硫酸小檗碱注射液(河南亚卫动物药业有限公司，110103，10 mL:0.1 g);乙睛为色谱纯;水为高纯水;其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱 C18柱(Waters公司，X BridgeTM，4.6 ×150 mm，5.0 μm);流动相为 0.1%磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至3.5±0.1)—乙腈(70∶30);流速为1.0 mL/min;检测波长为229 nm;进样体积为10 μL。在此色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品10.5mg，置100mL量瓶中，加流动相适量振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 色谱图

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定 精密量取对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。另精密称取硫酸小檗碱原料10.2 mg，置100 mL量瓶中，加流动相适量振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。以流动相为空白，在200～500 nm范围内扫描约10 μg/mL的对照品溶液和硫酸小檗碱溶液的吸收光谱，见图2。由图2可知:对照品溶液和硫酸小檗碱溶液的吸收光谱几乎完全重叠，两者均在 229、265、347、424 nm 波长附近有最大吸收，其中229 nm附近吸收度最大，为提高测量的灵敏度，实验选择229 nm作为检测波长。

图2 吸收光谱

2.2 供试品溶液的制备 精密量取硫酸小檗碱注射液1 mL，置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 线性关系 分别精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按 1.2.1 项下色谱条件进行测定，以峰面积的积分值对盐酸小檗碱质量进行回归，线性图见图3。盐酸小檗碱线性范围为0.2～2.5 μg，回归方程为 A=4 161 950 m+408 151(相关系数r=0.999 9)。说明色谱峰面积的积分值和盐酸小檗碱质量呈良好的线性关系。

图3 线性图

2.4 精密度试验 精密量取对照品溶液10 μL，连续6次进样，盐酸小檗碱峰面积积分值 RSD为0.2%。精密量取供试品溶液10 μL，连续6次进样，硫酸小檗碱峰面积积分值RSD为0.3%。

2.5 供试品溶液稳定性试验 供试品溶液放置0、1、4、6、12、24 h 后，精密吸取10 μL 进样，硫酸小檗碱峰面积积分值RSD为1.0%。

2.6 加样回收试验 分别取盐酸小檗碱对照品约8、10、12 mg，精密称定，置 200 mL 量瓶中，精密量取硫酸小檗碱注射液1 mL，置同一200 mL量瓶中，加流动相50 mL，振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀。按1.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表1。由表1可知:盐酸小檗碱平均加样回收率为100.8%，RSD为2.2%。

表1 加样回收试验结果(n=9)

2.7 样品测定 取2.2项下供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件测定峰面积，以外标法计算含量，并将计算结果乘以转换因子1.107。结果表明:硫酸小檗碱平均含量为10.7 mg/mL，RSD为0.5%(n=5)。比滴定法测定结果10.4 mg/mL，RSD 为0.7%(n=5)稍有偏高。

2.8 讨论 由于目前暂时无法购得硫酸小檗碱对照品，所以本实验采用盐酸小檗碱作为对照品对硫酸小檗碱注射液进行含量测定。因为无论硫酸小檗碱还是盐酸小檗碱其有效成分均为小檗碱，且分子中盐酸分子和硫酸分子在溶解于溶剂后即和小檗碱分离，溶液中小檗碱以离子态存在，所以通过测定供试品溶液中盐酸小檗碱的量再乘以转换因子即可求得硫酸小檗碱的含量。

转化因子的计算方法是基于以下的原理:直接以外标法计算所得含量是供试品中盐酸小檗碱的含量，先将其乘以盐酸小檗碱分子中小檗碱所占的分数(小檗碱分子量/盐酸小檗碱分子量)转化为小檗碱的含量，再将其除以硫酸小檗碱分子中小檗碱所占的分数(小檗碱分子量×2/硫酸小檗碱分子量，一个硫酸小檗碱分子中有2个小檗碱分子故分子上需要乘以2)转化为硫酸小檗碱的含量。所以转换因子计算方法为:硫酸小檗碱分子量/(盐酸小檗碱分子量 ×2)=822.84/(371.82 ×2)≈1.107。

高效液相色谱法测定硫酸小檗碱注射液含量时，由于实验室盐酸小檗碱对照品量较少而未对其进行水分测定。对照品标签上无含量，也无使用说明书可查阅，计算时对照品含量未折去水分而按100%计，故可能造成结果比滴定法偏高。对照品含量的准确性是提高测量结果准确性的关键因素。

盐酸小檗碱溶液和硫酸小檗碱溶液吸收光谱几乎完全相同，说明溶液的吸收光谱主要是由小檗碱的光学特性决定的。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药规范一九九二年版一部［S］.

［2］李华岑，张闪烁，张跃京，等.高效液相色谱法同时测定诺氟沙星和盐酸小檗碱的含量［J］.中国兽药杂志，2011，45(1):14-15.