超高效液相色谱-二极管阵列检测器检测中药散剂中磺胺类药物

刘素梅，韩 立，方忠意，李华岑，王 丽，张跃京，臧合英

(1.河南省兽药监察所，郑州 450008;2.郑州大学药学院，郑州 450001)

随着食品安全逐渐成为全球性的热点话题，畜产品中兽药残留问题对动物性食品安全的影响逐渐凸显出来。中药在畜牧生产中作为药物或饲料添加剂用于防治动物疾病、提高动物生产性能、改善产品品质越来越受到重视。但有些不法企业为了增强中药的疗效，常在中兽药中非法添加化学药物，造成畜禽机体中毒，产品中兽药残留超标等问题，严重危害人们的健康。

磺胺类药物为化学合成抗菌药，其中有些成分具有抗原虫作用，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺对甲氧嘧啶等，鸡球虫散和驱虫散为《中国兽药典》中收载的抗原虫的药物，本试验对这两种散剂中添加上述磺胺类药物进行了高效液相色谱法的研究［1］，利用二极管阵列检测器进行样品的全波长扫面，根据样品的色谱保留时间、吸收光谱进行定性检查，以色谱峰面积进行定量计算，可以快速准确地检查出中药中是否添加磺胺类药物及其含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备 Waters UPLC超高效液相色谱，二极管阵列检测器，Empower2色谱工作站;MILIPORE超纯水器;METTLER XP205电子天平。

1.2 试药及试剂 磺胺嘧啶对照品由中国兽医药品监察所提供，批号为H0361103，含量为100.0%;磺胺二甲嘧啶钠对照品由中国兽医药品监察所提供，批号为 H0371008，含量为99.8%;磺胺间甲氧嘧啶钠对照品由中国兽医药品监察所提供，批号为C0031007，含量为99.4%;磺胺对甲氧嘧啶对照品由中国兽医药品监察所提供，批号为H040105，含量为100%;磺胺氯吡嗪钠对照品由中国兽医药品监察所提供，批号为H0281207，含量为100.0%;磺胺喹噁啉对照品由中国兽医药品监察所提供，批号为H121104，含量为99.0%;鸡球虫散由郑州神普科技有限公司提供;驱虫散由河南旭隆兽药有限公司提供;甲醇和乙腈为色谱纯试剂，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1×100 mm)色谱柱;检测波长范围:190～400 nm，柱温30℃，进样量为3 μL;流动相 A相:0.017 mol/L的磷酸溶液，B相:乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 标准工作液的制备 精密称取六种磺胺类药物各100 mg分别置50 mL量瓶中，加甲醇配成2 mg/mL的标准贮备液，临用前用流动相稀释成浓度为 0.2、0.5、1、5、20、50、100、200 μg/mL 的标准混合工作液，过0.2 μm 微孔滤膜，即得。

2.3 样品制备

2.3.1 参照《兽药使用指南》里磺胺类药物的用量及向有关兽药企业技术人员了解，磺胺类的添加量在0.8% ～1%左右，所以本实验按照磺胺类药物含量为1%的量进行添加。取鸡球虫散和驱虫散各10 g，精密称定，分别精密加6种磺胺类药物各0.1 g，充分混匀，制成阳性样品(即磺胺类药物含量为1%)。

2.3.2 取鸡球虫散和驱虫散作为阴性样品。

2.4 供试品溶液的制备 取样品1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超声提取30 min，静置，精密量取上清液5 mL置50 mL量瓶中，加初始比例的流动相稀释至刻度，过0.45 μm滤膜，即得。

2.5 线性关系的考察 取磺胺类系列标准工作液，浓度由低到高依次进高效液相色谱仪，记录277 nm处色谱图，以对照品浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程和相关系数见表2，色谱图见图1-图5。

表2 回归方程和相关系数

2.6 准确度和精密度考察 精密称取2.3.1项下的阳性样品1 g，按照2.4项下供试品溶液的制备进行操作，进高效液相色谱仪分析，测定6种磺胺类组份的峰面积，计算回收率及RSD，结果见表3。

图5 鸡球虫散阳性样品色谱图

表3 回收率测定结果

2.7 检测限的确定 分别取一个鸡球虫散和驱虫散阳性样品谱图，计算每个组分的信噪比(S/N)，按S/N≥3为检测限，确定鸡球虫散和驱虫散中，检测限为0.02%。

2.8 定量限 按照信噪比(S/N)=10为定量限，确定定量限为0.05%。取驱虫散和鸡球虫散阴性对照1 g，加入阳性添加样品(1%)0.05 g，各5份，按照供试品溶液的制备方法进行处理，进高效液相色谱仪分析，计算回收率，结果见表4。

表4 定量限回收率试验结果

2.9 专属性 取驱虫散、鸡球虫散阴性样品各1 g，按照供试品溶液制备方法进行制备，进高效液相色谱仪分析，色谱图见图2、图4。由图可知，在该色谱条件下6种峰无干扰。

2.10 样品检测结果判定 供试品色谱图中如出现与相应对照品峰保留时间一致的色谱峰，查看该峰的光谱图，若与对照品光谱图无明显差异，最大吸收波长一致，则表示检出该组分。然后采用277 nm处峰面积，根据外标法计算含量。

2.11 HPLC色谱条件 由于条件局限，本实验采用的是超高效液相色谱-二极管阵列检测器进行试验研究。考虑到UPLC应用不如HPLC普遍，以270 nm为吸收波长，将色谱条件由UPLC的方法向HPLC进行了转换，具体色谱条件为:Waters 2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器，Empower2色谱工作站;XBridge C18(5 μm，4.6 ×150 mm)色谱柱，梯度洗脱程序见表5，柱温为30℃，进样量为20 μL。

表5 HPLC梯度洗脱程序

3 讨论

3.1 实验过程中先后尝试了甲醇-乙腈-水-冰乙酸系统［2］、乙腈-三乙胺溶液系统和乙腈-磷酸溶液系统［3］，最终确定柱效高、分离度好的乙腈-0.017 mol/L磷酸溶液系统作为流动相。

3.2 中药中基质复杂，干扰成分比较多，采用二极管阵列检测器，通过光谱鉴别可以排除干扰，准确地检测中药中是否添加磺胺类药物。

3.3 经过对6种磺胺类药物的反复试验，甲醇对这6种药物有很好的溶解性，因此，样品提取溶剂用甲醇。样品经过超声提取，提取效率高，同时考察了超声30 min和超声60 min的提取效果，结果两者没有显著差异，因此本实验选择了超声提取30 min的方法进行供试品溶液的制备。另外根据标准曲线线性范围，本实验选取了曲线中间点作为样品上机浓度。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版二部［S］.

［2］高迎春，苏 梅，魏秀丽，等.薄层色谱和液相色谱法鉴别中兽药散剂中掺加的磺胺喹噁啉钠［J］.中国兽药杂志，2010，44(2):23-25.

［3］动物源食品中磺胺类药物残留的检测方法-高效液相色谱法［S］.